Exploitation of chemo-multi-enzymatic cascade processes in the stereoselective synthesis of fine chemicals

The development of cleaner and more efficient chemical processes has become one of the main goals of chemical industry. Enzymes are considered intrinsically biodegradable and non-toxic, moreover catalyze a wide range of reactions with excellent chemo-, regio-, and stereoselectivity. Their capability of working under mild conditions and producing low amount of wastes and by-products is greatly appreciated, especially for the production of fine chemicals and bioactive molecules. In addition, the enzymes, with respect to the classical catalysis, are particularly suited to be integrated in cascade processes, since operate typically at very similar reaction conditions (room temperature, pH and atmospheric pressure). Last but not least, the set-up of multi-enzymatic processes is appealing because avoids possible substrate/product inhibitions. The biological activity of chiral molecules is strongly related to their absolute stereochemical configuration. For instance, in many cases only one stereoisomer of a drug is active, while its enantiomer exhibits often a different activity. For all these reasons, the stereoselective synthesis of chiral chemicals is become mandatory in industry. This research work has explored the effectiveness of integrating isolated enzymes and/or whole-cell in complex stereoselective synthetic procedures, in this regard the thesis has been organized in four main topics: 1. Design of stereoselective multi-enzymatic procedures: This part includes the design and development of new stereoselective multi-enzymatic procedures involving redox enzymes (Ene-reductases and Alcohol-dehydrogenases) for the obtainment of products of industrial relevance: i) the most pleasant odorous stereoisomers of the commercial fragrance Muguesia® and of the roasted meat Maillard flavor; ii) the four enatiomerically pure stereoisomers of the insect pheromone 4-methylheptan-3-ol. In addition, in this section I described the coupling of the ene-reductase activity with the reductive amination mediated by ω-transaminases enzymes. This multi-enzymatic process was applied for the transformation of -unsaturated ketones into enantiopure amines. 2. Development of tailored biocatalysts for specific applications in asymmetric synthesis by protein rational engineering: Herein, it is described the attempt to better understand the mechanism of binding of the substrates into the catalytic site of Ene-reductases OYE1 and OYE3. Indeed, despite the high similarity of the active sites we found different orientations that produce opposite stereochemical outcomes in the C=C double reduction. Especially, we explored the response of OYE3 to mutations at Trp 116 (OYE3-W116X library), which is highly influential for the OYE1 stereoselectivity. Moreover, I described the development of a fast and sensitive colorimetric assay (FRED, fast and reliable ene-reductases detection) for the estimation of conversions of the ene-reductase (ER)-catalyzed reactions, this methodology was very useful to test quickly a large number of variants on a screening scale. 3. Characterization of new enzymatic activities from filamentous fungi: In the third part is described the possibility to exploit the natural metabolic flux of the filamentous fungus Syncephalastrum racemosum as a multi-enzymatic cascade for the reduction of esters and carboxylic acids to primary alcohols; a new enzymatic activity, namely a carboxylic acid reductase, was identificated and its substrate scope was investigated. Subsequently, the screening of a panel of filamentous fungi for the identification of a new oxidative enzymatic activity was reported. Finally, this enzymatic activity was integrated in a 3-step chemo-biocatalytic stereoselective synthesis of chiral cyclic γ-oxoesters. 4. Screening of a collection of filamentous fungi for the identification of new enzymatic activities: This part includes the work done in collaboration with the research group of Prof. Cristina Varese (UniTo) for the screening of the fungal collection of the Mycoteca Universitatis Taurinensis (Department of Life Sciences and Systems Biology).

Lo sviluppo di processi chimici puliti ed efficienti è diventato uno dei principali obiettivi dell'industria chimica. Gli enzimi sono considerati intrinsecamente biodegradabili e non tossici, inoltre catalizzano un'ampia gamma di reazioni con eccellente chemio-, regio- e stereoselettività. La loro capacità di lavorare in condizioni blande e di produrre una bassa quantità di rifiuti e sottoprodotti è molto apprezzata, specialmente per la produzione di prodotti chimici fini e molecole bioattive. Inoltre, gli enzimi, rispetto alla catalisi classica, sono particolarmente adatti per essere integrati nei processi a cascata, poiché operano tipicamente in condizioni di reazione molto simili (temperatura ambiente, pH e pressione atmosferica). Infine, ma non meno importante, l'impostazione di processi multi-enzimatici è interessante perché evita possibili inibizioni del substrato / prodotto. L'attività biologica delle molecole chirali è fortemente correlata alla loro configurazione stereochimica assoluta. Ad esempio, in molti casi è attivo solo uno stereoisomero di un farmaco, mentre il suo enantiomero mostra spesso un'attività diversa. Per tutte queste ragioni, la sintesi stereoselettiva delle sostanze chimiche chirali è diventata essenziale nell'industria. Questo lavoro di ricerca ha investigato l'integrazione di enzimi isolati e / o di cellule intere in complesse procedure sintetiche stereoselettive, a questo proposito la tesi è stata organizzata in quattro argomenti principali: 1. Progettazione di procedure multi-enzimatiche stereoselettive: Questa parte comprende la progettazione e lo sviluppo di nuove procedure multi-enzimatiche stereoselettive che coinvolgono enzimi redox (Ene-riduttasi e alcol-deidrogenasi) per l'ottenimento di prodotti di rilevanza industriale: i) gli stereoisomeri odorosi più interessanti della fragranza commerciale Muguesia® e di il sapore di Maillard alla carne arrostita; ii) i quattro stereoisomeri enantiomericamente puri del feromone di insetto 4-metileptan-3-olo. Inoltre, in questa parte è descritto l'accoppiamento dell'attività dell'ene-reduttasi con l'amminazione riduttiva mediata dagli enzimi ω-transaminasi. Questo processo multienzimatico è stato applicato per la trasformazione di chetoni -insaturi in ammine enantiopure. 2. Sviluppo di biocatalizzatori per applicazioni specifiche nella sintesi asimmetrica mediante ingegneria proteica: Qui, è descritto il tentativo di comprendere meglio il meccanismo di legame dei substrati nel sito catalitico delle Ene-riduttasi OYE1 e OYE3. Infatti, nonostante l'elevata somiglianza dei siti attivi sono stati individuati diversi orientamenti che producono risultati stereochimici opposti nella riduzione di doppi legami C = C. Soprattutto, è stata investigata la risposta di OYE3 alle mutazioni su Trp 116 (libreria OYE3-W116X), che è molto influente per la stereoselettività in OYE1. Inoltre, è descritto lo sviluppo di un saggio colorimetrico veloce e sensibile (FRED, rilevamento rapido e affidabile delle ene-reduttasi) per la stima delle conversioni delle reazioni catalizzate da ene-reduttasi (ER), questa metodologia è stata molto utile per screenare rapidamente un gran numero di varianti. 3. Caratterizzazione di nuove attività enzimatiche da funghi filamentosi: Nella terza parte è descritta la possibilità di sfruttare il flusso metabolico naturale del fungo filamentoso Syncephalastrum racemosum come cascata multienzimatica per la riduzione di esteri e acidi carbossilici in alcoli primari; una nuova attività enzimatica, acido carbossilico reduttasi, è stata identificata e il suo spettro di substrati è stato investigato. Successivamente è stato riportato lo screening di una collezione di funghi filamentosi per l'identificazione di una nuova attività enzimatica ossidativa. Infine, questa attività enzimatica è stata integrata in una sintesi stereoselettiva chemo-biocatalitica in 3 fasi di γ-oxoesters ciclici. 4. Screening di una collezione di funghi filamentosi per l'identificazione di nuove attività enzimatiche: Questa parte comprende il lavoro svolto in collaborazione con il gruppo di ricerca della Prof.ssa Cristina Varese (UniTo) nello screening della collezione fungina della Mycoteca Universitatis Taurinensis (Dipartimento di Scienze della vita e Biologia dei sistemi).