Valutazione dell'osteoinduttività di un sostituto osseo : test in vitro per analizzare l'interazione tra SmartBone e cellule staminali mesenchimali isolate da tessuto adiposo

In the field of bone defects resolution, the regeneration obtained through tissue engineering is growing its importance and relevance. Even though in this scenario it is possible to find many innovative biomaterials, a lot of surgeons still prefer to use traditional methods as autologous grafts. For this reason, it is necessary to demonstrate the great potential of innovative biomaterials for bone regeneration. An optimal scaffold for bone regeneration needs to be highly porous, non-immunogenic, biostable during the entire process of formation and consolidation of new bone, bioresorbable, osteoconductive and, desirably, osteoinductive. The cells behavior is strongly influenced by the substrate they are in contact with, the optimization of which can be gained through surface modifications. Specially, chemical and physical scaffold features provide topological stimulations to address the differentiation of mesenchymal stem cells. In this framework, SmartBone® represents a good alternative to traditional approaches; it is an innovative xenohybrid graft for bone regeneration constituted by bovine spongy bone matrix, previously deproteinized thought soft acid attack to preserve its structure and then reinforced by a micrometric thin poly(l-lactic-co--caprolactone) (PLCL) film embedding RGD-containing collagen fragments, extracted by purified bovine gelatin, that overall result in increased mechanical properties, hydrophilicity, cell adhesion and osteogenicity. SmartBone® is currently used for clinical applications with evidences it provokes an optimal bone regeneration concurrently with the scaffold degradation, as demonstrate by the ex-vivo histological analysis conducted 4 months or more after the implant. Nevertheless, a deeper knowledge about the mechanism that brings to these results was needed. Hence, we aimed at developing and testing methods to investigate the biological phenomena occurring in the early stage of the regeneration process, through the analysis of cell cultures at respectively 15, 30 and 60 days. Stated that in vivo microenvironmental factors play a key role in promoting bone regeneration, unluckily hard to replicate in vitro, to reproduce in vitro biological conditions as close as possible to the in vivo ones, primary cells were used, particularly mesenchymal stem cells (ASCs) and stromal vascular fraction (SVF) isolated from fresh or cryopreserved lipoaspirated adipose tissue. SVF and ASCs were cultured on tissue culture plastic and on SmartBone® discs (7x3mm – made to fit into multiwells), at a concentration of 1x106 SVF cells and 1x105 ASCs, in α-MEM with 10% of FBS, 2mM Glutamine and 1% antibiotics or in osteogenic medium containing: α-MEM supplemented with 10% FBS, 50mg/ml ascorbic acid, 10-8M dexamethasone and 10mM β-glycerophosphate. At first, SVF and isolated ASCs phenotype was analyzed by flow cytometry to prove cells’ multipotency. Cells cultured on tissue culture plastic were used to monitor the osteoblast differentiation by bone alkaline phosphatase (BAP) staining and to evaluate the osteoblasts’ mineralization activity through the detection of mineralized nodules by Von Kossa staining. In absence of osteogenic factors ASCs were BAP negative, while BAP positive cells were detected in SVF cultures, suggesting the presence of committed ASCs in SVF. Both ASCs and SVF cultures with osteogenic medium were BAP positive. Then we looked at the mineralization ability of both ASCs and SVF, as readout of their activity, by Von Kossa staining observing that both cell cultures did not mineralize in absence of osteogenic factors while they did in their presence. In order to define the osteoinductivity ability of SmartBone®, morphological (H&E, ESEM and Micro-CT) and molecular (IHC) analysis were carried out on samples cultured with ASCs and SVF. Hematoxylin and eosin (H&E) staining showed that both ASCs and SVF assumed the typical fibroblast-like morphology, colonized SmartBone® and formed new tissue on this biomaterial, starting from the periphery and filling bone lacunas, both in absence or in presence of osteogenic factors, suggesting that SmartBone® is osteoinductive by itself. The localization and expression of bone ECM’s biomolecules and the expression of bone surface markers and growth factors were evaluated with immunohistochemical (IHC) analysis, detected by antigen-antibody reactions: type I collagen (COLL-I), osteocalcin (OCN) and TGF-β. At 60 days, in absence of osteogenic factors, SmartBone® cultured with ASCs resulted weakly positive for COLL-I fibers, whereas in culture with SVF COLL-I was highly expressed. In presence of osteogenic medium, both in cultures with ASCs and SVF, COLL-I markedly stained the new tissue on SmartBone®. Osteocalcin resulted weakly positive in α-MEM, whereas it was highly expressed with osteogenic medium, mainly on the periphery of new formed tissue. Finally, TGF-β highlighted osteoblasts at the margin of the new formed tissue both in SVF and ASCs under both culture conditions. At the scanning electron microscopy (SEM) analysis cells showed a fibroblast-like morphology coherently with the histological images: cells are able to adhere and to proliferate on the biomaterial until they completely covered its surface and created multiple cell layers. New tissue formations were more evident in SVF cultured in osteogenic medium. Finally, to monitor and quantify the tissue formation on SmartBone®, we checked the presence of new tissue by Micro-CT, showing a progressive increase in tissue formation during time, from 15 to 60 days, both in absence or in presence of osteogenic factors. These results confirmed that new tissue formations were significantly higher in samples cultured with SVF in presence of osteogenic factors. As far as ASCs are concerned, the formation of new trabeculae was higher in SmartBone® samples cultured in absence of osteogenic factors. These data confirm the osteoinductive properties of SmartBone®, assessed by evaluating the capability of ASCs and SVF to differentiate into osteoblasts when cultured on it.

Nel vasto ambito della risoluzione dei difetti ossei è, ad oggi, di grande interesse la rigenerazione ottenuta mediante ingegneria dei tessuti. Nonostante siano stati sviluppati numerosi materiali innovativi, ciascuno dei quali caratterizzato da un diverso grado di osteogenesi, molti chirurghi preferiscono ancora seguire metodi consolidati ricorrendo all’utilizzo di graft autologhi. Pertanto, è necessario dimostrare le grandi potenzialità dei sostituti ossei di nuova generazione. Uno scaffold ideale per la rigenerazione ossea deve possedere elevata porosità, deve essere non immunogenico, biostabile fino alla formazione di nuovo tessuto, bioriassorbibile, osteoconduttivo e possibilmente osteoinduttivo. Il comportamento delle cellule è fortemente influenzato dal substrato con il quale sono in contatto, la cui ottimizzazione si può ottenere mediante una modifica della superficie. Nello specifico, le caratteristiche chimico-fisiche del sostituto osseo forniscono stimoli topologici ai quali le cellule staminali rispondono con cambiamenti comportamentali indirizzando il proprio percorso di differenziamento. In tale contesto, SmartBone® si propone come candidato ideale in alternativa agli approcci tradizionali; si tratta di un innovativo sostituto osseo composto da una matrice di osso spongioso bovino, deproteneizzata mediante attacco acido debole per preservarne la struttura, rivestita di un copolimero sintetico biodegradabile, PLCL, e di gelatina al fine di migliorare la stabilità volumetrica e la bagnabilità all’impianto. La gelatina è stata scelta in quanto offre sequenze RGD alle cellule così da supportare la loro adesione e proliferazione, permettendo alle cellule circostanti di penetrare all’interno del ricostitutivo osseo, caratteristica chiave per una rapida attivazione del processo di formazione di nuovo tessuto e riassorbimento di SmartBone®. SmartBone® è correntemente utilizzato per applicazioni cliniche ed i risultati promettenti mostrano che induce un’ottima rigenerazione ossea, contemporanea al suo degradamento, come evidenziato dalle analisi istologiche ex-vivo compiute in fase di controllo post-impianto dopo 4 mesi o più. Si è reso quindi necessario sviluppare e testare metodi di indagine che permettessero di approfondire puntualmente la conoscenza dei meccanismi biologici che avvengono nei primi stadi della formazione di nuovo osso, scegliendo come tempi di analisi delle colture cellulari 15, 30 e 60 giorni. Stabilito che un ruolo di primaria importanza nel processo di rigenerazione ossea è svolto dal microambiente locale in vivo, ben più complesso di quanto si possa riprodurre in vitro, al fine di simulare condizioni il più simili possibile a quelle in vivo, sono state utilizzate cellule primarie ed in particolare cellule staminali mesenchimali (ASCs) e frazione vascolare stromale (SVF) isolate da tessuto adiposo lipoaspirato, in parte fresco ed in parte crioconservato. Le cellule sono state seminate sui campioni di SmartBone® e su piastre di controllo in quantità pari a 1*106 cellule della SVF e 1*105 ASCs, sia in semplice terreno α-MEM addizionato con 10% di FBS, 2mM glutammina, 1% di pennicillina e streptomicina, che con aggiunta di fattori osteogenici (50 µg/ml di acido ascorbico, noto anche come vitamina C, dexametasone 10-8 M e β-glicerofosfato 10-3 M), condizioni di induzione specifiche per la linea ossea. Preliminarmente, la frazione vascolare e le cellule mesenchimali isolate sono state caratterizzate fenotipicamente mediante analisi al citofluorimetro, per dimostrarne la multipotenza. Le cellule seminate su piastre di controllo sono state utilizzate per verificare, mediante colorazione per l’attività dell’enzima intracellulare fosfatasi alcalina ossea (BAP) e colorazione per la mineralizzazione (Von Kossa), la capacità di differenziare nella linea osteogenica in presenza di stimoli appropriati. Per quanto riguarda le ASCs, la colorazione per la BAP, indice di maturazione osteoblastica, ha mostrato una positività apprezzabile solo in presenza di fattori osteogenici; di contro, nelle colture di SVF sono state riscontrate cellule positive alla BAP anche in assenza di fattori osteogenici, indice della presenza di cellule in via di differenziamento in senso osteogenico. In entrambe le colture cellulari, la colorazione di Von Kossa ha evidenziato nei campioni osteoindotti la presenza di granuli di calcio, pressochè assenti invece in assenza di fattori osteogenici. Al fine di definire il ruolo e l’entità dell’osteoinduttività apportata nel processo di formazione di nuovo osso, i campioni di SmartBone® seminati con ASCs e SVF sono stati analizzati dal punto di vista sia morfologico (colorazione con H&E, analisi SEM e Micro-CT) che molecolare (analisi di IHC). La colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) ha evidenziato che le cellule sono state in grado di aderire al sostituto osseo, assumendo la tipica morfologia fibroblastoide, colonizzarlo ed espandersi fino a riempire gli spazi vuoti presenti tra le trabecole. Grazie ad analisi di immunoistochimica (IHC) è stata compiuta una caratterizzazione avanzata del differenziamento cellulare in senso osteogenico mediante la valutazione dell’espressione di biomolecole della ECM ossea, di marcatori per osteoblasti maturi e fattori di crescita specifici per la linea ossea ottenuta per mezzo di reazioni antigene-anticorpo: collagene di tipo I (COLL-1), osteocalcina (OCN) e TGF-. In assenza di fattori osteogenici, il collagene di tipo I è risultato debolmente espresso nei campioni di SmartBone® coltivati con ASCs, fortemente espresso invece nelle colture con SVF. Nelle colture osteoindotte sia di SVF che di ASCs, è stata riscontrata una marcata presenza di COLL-1 sul nuovo tessuto cresciuto su SmartBone®. L’osteocalcina è risultata debolmente positiva in α-MEM, fortemente espressa invece in presenza di fattori osteogenici, in modo più evidente sul perimetro del tessuto neo-formato. Infine, il TGF- ha evidenziato la presenza di osteoblasti sul margine del nuovo tessuto in misura uguale nella SVF e nelle ASCs, in entrambe le condizioni di coltura. Alle analisi al microscopio elettronico la morfologia delle cellule è apparsa allungata ed in completo accordo con le immagini istologiche, dunque le cellule sono state in grado di aderire e proliferare sul biomateriale fino a coprire omogeneamente la superficie del biomateriale, creando molteplici strati cellulari. In particolare, le neo-formazioni sono risultate maggiormente evidenti nei campioni coltivati con SVF in terreno arricchito di fattori osteogenici. È stata infine compiuta una valutazione quantitativa delle trabecole neo-formate a 60 giorni, confermando che le formazioni di neo-tessuto risultano significativamente superiori in presenza di SVF coltivata in presenza di fattori osteogenici. Per quanto riguarda le ASCs, è stata riscontrata maggior formazione di nuove trabecole nei campioni di SmartBone® coltivati in assenza di fattori osteogenici. Questi dati hanno quindi confermato le proprietà osteoinduttive di SmartBone®, dimostrate osservando la capacità da parte delle ASCs e delle cellule della SVF di differenziare in osteoblasti se coltivate sul biomateriale.