Analisi comparativa e revisione critica di modelli per l'ingegnerizzazione del muco gastrointestinale

Mucus is a viscoelastic secretion that is continuously synthesized by muciparous and goblet cells in the columnar epithelium. It lines all of the organs that are exposed to the external environment, namely repiratory, gastrointestinal, reproductive and oculo-rhino-otolaryngeal tracts. In the gastrointestinal tract, the mucus acts like a dynamic, semipermeable barrier that lets nutrients, drugs, and neurotrasmitters pass, but it limits pathogens and noxious substances diffusion. Within the gastrointestinal tract, mucus bears approximately 1018 bacteria density that bind to it, which regulates part of the immune system, secretes vitamins and neurotrasmitters and helps the gastrointestinal organs to digest lipids and carbohydrates. Mucus is also involved in many disease processes, in fact, in these cases, the composition and the structure of mucus is altered, which hampers its barrier function. Mucus is a biological hydrogel composed by water and high molecular weight glycoproteins called mucins. Mucins are composed of two regions: a highly glycosylated and hydrophilic region and a “naked”, hydrophobic, proteic region. Other components are lipids, proteins, DNA and salts. It is classified as a non-Newtonian shear-thinning gel, which complex structure and physical behaviour allow interactions with different type of substances. Aiming to elucidate the role of mucus over both substances delivery and maintaining the microbiote, several in vivo, ex vivo and in vitro models have been developed. With this in mind, an extensive research on the literature was herein performed to analyse the different types of models, while pointing out the aspects that closer simulate the in vivo conditions. Furthermore, the rheological and diffusive features displayed by these models were further compared to the ones exhibited by native human or animal mucus. This thesis envisions to demonstrate that, even if up to now, there is no model that can mimic both the rheological and the diffusive properties of native human or animal mucus, a new one can be design by combining the positive results in terms of rheological properties of a model to the diffusive properties of another. Up to date, the proposed models are mainly focused on either the mucosa tissue or only on mucus. The models that studies animal mucosal tissue involve in vivo or ex vivo tissues, among which intestinal perfusion is the most common method to study drug permeability. The results obtained through this method turn out to be extremely variable inter-individually and intra-individually and, in case of ex vivo tissue, lack of vitality. Yet, in vivo studies on human mucosa are very limited due to low numbers of volunteers. Models focused on mucus can be classified into three categories: mucin-based solutions, material-based models (that include lipids, proteins, DNA and synthetic polymers), and cell-based models Mucin-based models mainly comprise solutions made of mucins that are either isolated from animals or commercial available. Attempts have been also made to use the reconstituted mucins to form gels. Though, these type of models do not mimic the native mucus composition and the purification process causes gel degradation that by being weak do not simulate the diffusive properties. Improved material-based models that intend to model the diffusive properties of native mucus have been recently proposed. Such models are composed of purified porcine gastric mucin and blend of lipids, proteins, DNA, as well as other synthetic compounds. These models are widely spread due to their usability: they are made of materials largely available and do not involve cells or ex vivo tissue, so the development of the model is easy and the experiments are repeatable in a restricted period of time. The chemical multicomposition is closer represented than mucin-based models, and both in vivo condition and physical properties are more similar to those of native mucus. Particularly, it is demonstrated that adding synthetic polymers to the model composition result in rheological properties similar to those of human native mucus. The most promising model, is a multicomponent gel model (due to the presence of different materials and the addition of crosslinkable polymer) that among the analysed models mimics accurately the rheological properties. It contains, beside mucins (50 mg/ml), bovine serum albumin (31 mg/ml), a lipids compound (linoleic acid, colestherol, phosphatidilcoline) (6,5 mg/ml) and polyacrilic acid. Thanks to the introduction of the this polymer at 9 mg/ml the model replicates the conservative and the dissipative moduli human mucus, yet to model the viscosity a lower concentration of 3 mg/ml was used. The diffusive properties of another material-based model, named multicomponent organic model (due to the presence of DNA) were analysed by testing two drugs, such as mannitol and testosterone. This model is constituted by purified porcine gastric mucin (4,24 mg/ml), a lipid compound (linoleic acid, colestherol, phosphatidilcoline) (31,8 mg/ml), porcine albumin serum (32,8 mg/ml) and DNA (5,3 mg/ml). The results show good correlation with the ones obtained in the animal native mucus model. Among the different models, the most suitable rheological properties are achieved by models that combine a high concentration of mucin with the addition of the polyacrylic acid (multicomponent gel model), while adequate diffusive properties are better attained by models that contain high concentration of lipids (multicomponent organic model). Taking into inspiration the positive outcomes that these models exhibit, a new model can be designed to simulate both the rheological and diffusive properties, possibly by controlling chemical composition and concentrations, as well as structure. Adding cells to the artificial models could increase both similarity with the native anatomy and the difficulties about the design, the development and the maintenance of the model. Several studies in literature have developed cell-based models based on mono-, double- or triple cell culture in order to better represent the different cell types encountered in vivo. However, the implemented cells used are either damaged due to the extraction process or immortalized cell lines that show differences over protein synthesis with respect to primary cell lines. These variations are reflected on the secreted mucus that point out dissimilar structural and adhesive features. Moreover culture conditions are very difficult to maintain. Additionally, tridimensional cell culture models have also been proposed. In this case, cells organize themselves in a 3D structure thanks to the presence of a synthetic or decellularized scaffold and are continuously stimulated by medium flow that provides nutrients, while removing waste materials. These types of models comprise a very complex building process, starting from the scaffold material choice, the bioreactor design and the cell culture maintenance. Recent work has been focused on stems cells from intestinal crypts, embrionary source or iPS cells. Stem cells have been embedded on Matrigel together with growth factors to form spheroids, a three-dimensional structure, within which they could differentiate and organize themselves. A study reported good results in term of differentiation: in the culture there can be distinguished Paneth cells, enterocytes, enteroendocrine and goblet cells. No diffusion studies have been performed on this type of cell-based models because of the difficulty of injecting drugs into Matrigel. This together with difficult culture conditions due to the presence of stem cells has limited the application of this type of cell-based models. Design gastrointestinal mucus models aims to reproduce in vitro the anatomy, structure and physical properties of native mucus in order to understand the barrier properties and characterize the environment where microbiota lives. Goals have been partially reached by different models. Material-based models are characterized by a simple design process and do not include ex vivo tissue or cell cultures. Some of them can simulate native mucus rheological properties and some native mucus’ diffusive properties. Yet, none of them mimics the native anatomy. Cell-based mucus models resemble the physiological tissue in term of cell types and organization, but the development of the model is difficult because of the cell sources that secrete mucus, which has different features with respect to the native one. Difficulties related to maintenance of the cell culture system and apparatus design that often involves bioreactors and scaffolds hamper its applicability. Each of the analysed models shows similarities to few in vivo aspects but no-one is able to represent the in vivo situation, or to be trusted as in vitro drug screening platform. So after the extensive literature research a mucus model that simulates the rheological and diffusive properties has been envisioned. The model could contain beside mucin and proteins a medium concentration of 6 mg/ml of polyacrylic acid whose introduction could better mimic the rheological properties and a higher concentration of lipids like 30 mg/ml that could improve the diffusive properties. The dissertation is structured in different chapters: 1) introduction that provides an overview of the gastrointestinal anatomy, and of chemical, structural and rheological properties of mucus, 2) an extensive literature research in which the models are classified in categories and the advantages and the disadvantages of each are underlined 3) aim of the work, 4) extraction of results of rheological and diffusive experiments from literature models and comparison among them, 5) discussion of the extracted data and futher development.

Nel presente lavoro di tesi è stata svolta un’analisi comparativa e una revisione critica di modelli di mucosa e muco gastrointestinale presenti in letteratura. I modelli del muco gastrointestinale trovano impiego nello studio della diffusione di nutrienti, neurotrasmettitori e farmaci attraverso il muco e nello studio delle proprietà reologiche che influenzano il passaggio, l’adesione e la proliferazione di batteri. Il muco è classificato come una barriera dinamica e semipermeabile: è continuamente secreto e digerito dalle cellule mucipare nello stomaco e dalle cellule di goblet nell’intestino, permette la lubrificazione di cibo ed il passaggio di sostanze verso gli organi target, è sede del microbiota e, se è in condizioni fisiologiche, blocca il passaggio di agenti patogeni. Dal punto di vista chimico è un idrogelo biologico composto da glicoproteine ad alto peso molecolare, dette mucine, da lipidi, proteine, DNA e frammenti cellulari. La complessità chimica si riflette nel comportamento fisico stabilendo interazioni sia con composti idrofilici che con composti idrofobici. Dal punto di vista reologico si comporta come un fluido non newtoniano reofluidificante. Con lo sviluppo di modelli di muco ci si pone come scopo quello di simulare l’ambiente in vivo. Data la complessità delle caratteristiche chimiche, strutturali e fisiche del tessuto fisiologico sono stati presentati diversi approcci. Si possono individuare due grandi classi: i modelli che si occupano di studiare l’intero tessuto e quelli che si concentrano sullo strato di muco. I modelli di mucosa gastrointestinale vertono sullo studio della diffusione di farmaci tramite perfusione intestinale in vivo o su tessuti ex-vivo. I dati che ne derivano sono caratterizzati, rispettivamente, da variabilità intra e inter-animale e dalla mancanza di vitalità del tessuto. Inoltre richiedono la soppressione dei soggetti coinvolti. I modelli che si focalizzano sul muco gastrointestinale possono essere classificati in modelli basati su soluzioni di mucina, modelli di muco artificiale e modelli cellulari. I modelli di muco basati su soluzioni di mucina (estratti da muco nativo animale o commercialmente disponibili) non rispecchiano le componenti chimiche del muco nativo che oltre alla glicoproteina principe includono altre specie chimiche. Il processo di purificazione, necessario per l’estrazione, causa la degradazione della struttura rendendo il gel più debole. Prove di diffusività e mobilità di particelle nanometriche hanno dimostrato che le soluzioni di mucina non simulano adeguatamente le caratteristiche del muco porcino: la soluzione diffonde di più proprio a causa delle sue caratteristiche chimico-fisiche. La composizione chimica incompleta impedisce la formazione di interazioni che limiterebbero la diffusività e la mobilità delle particelle. Sono stati proposti modelli di muco artificiale costituiti da soluzioni di mucina gastrica porcina a cui si aggiungono in diverse concentrazioni miscele di lipidi, proteine, DNA e sali inorganici. Il largo utilizzo di questi modelli è dato dalla loro fruibilità: permettono di ripetere gli esperimenti in tempi ridotti grazie all’utilizzo di materiali che non prevedono l’inclusione di tessuti ex-vivo. La composizione chimica più completa si riflette in una migliore simulazione delle proprietà fisiche. È stato dimostrato come, ottimizzando le concentrazioni dei reagenti e aggiungendo polimeri addensanti, i modelli artificiali simulino in maniera soddisfacente le proprietà reologiche del muco nativo umano. I risultati migliori sono stati ottenuti dal modello multicomponente in gel in cui oltre alla mucina (50 mg/ml), all’albumina di siero bovino (31 mg/ml) e ad una miscela di lipidi (acido linoleico, colesterolo, fosfatidilcolina) (6,5 mg/ml) è stato aggiunto in varie concentrazioni l’acido poliacrilico. Esso alla concentrazione di 9 mg/ml simula in maniera soddisfacente il modulo conservativo e il modulo dissipativo del muco umano mentre non mima i valori della viscosità per cui il modello che si avvicina di più è quello a più bassa concentrazione di acido (3 mg/ml). Volendo simulare con sufficiente accuratezza sia il modulo conservativo e dissipativo sia la viscosità si potrebbe proporre un modello con concentrazione di polimero intermedia (6 mg/ml). Adeguati valori di diffusione sono registrati nel modello multicomponente completo che studia il passaggio di farmaci come mannitolo e testosterone. Il modello è composto da mucina gastrica porcina a bassa concentrazione (4,24 mg/ml), elevata concentrazione di lipidi (31,8 mg/ml), albumina di siero porcino (32,9 mg/ml) e DNA (5,30 mg/ml). Le proprietà diffusive del modello così costruito sono confrontabili con quelle misurate sul muco nativo porcino. In entrambi i modelli il mannitolo diffonde in quantità maggiore rispetto al testosterone che viene bloccato dalle interazioni con i lipidi, a causa del peso molecolare maggiore (288 g/mol rispetto a 182 g/mol) e dall’ingombro sterico che caratterizza la molecola. Dall’analisi effettuata su diversi modelli artificiali si ha che le proprietà reologiche più adeguate si hanno con concentrazioni elevate di mucina (50 mg/ml), aggiunta di polimeri addensanti (6 mg/ml) mentre per avere proprietà diffusive buone si deve incrementare la concentrazione di lipidi (circa al 30 mg/ml) che non devono essere presenti in un’unica specie ma in una miscela che rappresenti la varietà registrata nel muco nativo. Si potrebbe quindi progettare un modello di muco artificiale ottimizzando le concentrazioni di mucina, lipidi e polimeri addensanti in base ai risultati positivi ottenuti per la parte reologica dal multicomponente in gel e per la parte diffusiva nel modello multicomponente completo. Un confronto sistematico dei dati potrebbe essere condotto partendo dai dati estratti dalla letteratura se i lavori proposti riportassero gli stessi esperimenti con campioni omogenei. Tuttavia ciò succede di rado, ma è comunque possibile un confronto tra i modelli che effettuano prove simili. Lo studio è reso più ostico dalla carenza di dati relativi al muco umano, se gli studi su di esso fossero presenti in numero maggiore non solo si potrebbero avere informazioni più precise sulle concentrazioni delle specie chimiche da includere nel modello artificiale ma si potrebbe fare in confronto significativo tra i risultati ottenuti dai modelli e quelli registrati sull’uomo. L’evoluzione dei modelli artificiali è rappresentata dall’inclusione delle cellule in coltura a simulare l’epitelio. Ciò contribuisce, da un lato, ad aumentare la similarità con la situazione in vivo, ma dall’altra complica la realizzazione del modello: sono utilizzate cellule danneggiate dalla sottrazione del muco e che provenendo da linee cellulari immortalizzate sintetizzano proteine diverse rispetto a quelle che verrebbero prodotte da cellule di linea. Questi aspetti conferiscono al muco secreto da queste cellule caratteristiche strutturali e adesive diverse da quelle riscontrate dal muco in vivo. È stato dimostrato che sebbene i valori di permeabilità siano simili a valori misurati su muco nativo questi siano in grado di simulare il solo trasporto passivo ciò a causa di una ridotta sintesi di proteine carrier nel modello rispetto al muco. Sono stati proposti modelli cellulari statici di mono, co e tripla coltura allo scopo di mimare con accuratezza crescente la popolazione cellulare dell’epitelio gastrico. Tuttavia, con l’accuratezza aumenta anche il grado di difficoltà nel mantenere colture cellulari complesse. Le problematiche aumentano con i modelli cellulari tridimensionali in cui le cellule sono seminate su uno scaffold sintetico o su tessuto ex vivo decellularizzato. Le cellule si organizzano tridimensionalmente simulando una struttura più simile al caso in vivo e maggiormente esposta agli stimoli chimici e fisici. Studi su questo tipo di modello hanno riportato valori di permeabilità inferiori a quelli riportati nel caso bidimensionale. A ciò si aggiunge la complessità dello sviluppo del modello che necessita della progettazione di uno scaffold e di un bioreattore in cui mantenere una coltura cellulare costituita da diversi tipi. Il processo di progettazione si complica ulteriormente se si passa allo studio di un modello costituito da un sistema microfluidico e da cellule in coltura: il sistema di diffusione è costituito da due parti in poliestere ciascuna dotato di microcanali in PDMS, interposto tra i due vi è un filtro permeabile. Le cellule CaCO-2 sono inoculate sul versante apicale della membrana. Tramite una micropompa magnetica situata nei circuiti le cellule sono sottoposte ad un flusso continuo di medium che porta il nutrimento alle cellule, le stimola meccanicamente mediante uno sforzo di taglio controllato e impedisce il ristagno di sostanze di scarto. Il sistema è sensorizzato tramite il posizionamento di fibre ottiche che misurano il passaggio di particelle fluorescenti. Studi sulla permeabilità in cui sono state coinvolte le sole cellule CaCO-2 hanno riportato valori simili a quelli riportati nelle colture statiche. La progettazione del sistema è articolata: bisogna scegliere i materiali per ogni componente, dimensionare il bioreattore tenendo conto delle dimensioni di ciascun elemento e dello spessore di uno strato di muco, della sensorizzazione e del mantenimento delle cellule in coltura. Recenti lavori si concentrano sull’utilizzo di cellule staminali che differenziandosi e organizzandosi tridimensionalmente riproducono la struttura generale di un organo, miniaturizzato. Si espiantano le cripte intestinali che contengono cellule staminali o cellule embrionali oppure si utilizzano cellule staminali a pluripotenza indotta. Esse sono seminate nel Matrigel a simulare la matrice extracellulare e messe in coltura con fattori di crescita. Uno studio ha riportato buoni risultati procedendo con l’isolamento di cellule staminali dall’epitelio digestivo umano e la successiva inoculazione sul Matrigel con diversi fattori di crescita. La coltura porta alla produzione di strutture simil-cripte intestinali. In questo caso la differenziazione riflette la popolazione cellulare fisiologica: si possono distinguere le cellule di Paneth, gli enterociti, le cellule enteroendocrine e le cellule di goblet. Non ci sono prove riguardo alla diffusione di farmaci perché è difficile sia iniettare sia osservare il farmaco all’interno del Matrigel. Questo motivo, che si aggiunge alla coltura complessa di cellule staminali, spiega l’uso per ora limitato di questo modello. Lo studio e la progettazione di modelli di muco gastrointestinale si pone come triplice scopo quello di riprodurre la struttura anatomica del tessuto e di simulare le proprietà chimico/fisiche e le funzioni fisiologiche. Gli obiettivi sono parzialmente raggiunti seppure da modelli diversi. I modelli di muco artificiale sono prodotti in laboratorio, non richiedono l’utilizzo di cellule o tessuti ex-vivo e sono tuttavia in grado di simulare con sufficiente accuratezza la composizione chimica e le proprietà reologiche e diffusive del muco nativo. I modelli cellulari mimano con maggiore fedeltà l’architettura fisiologica del tessuto ma devono essere ottimizzati per quanto riguarda la secrezione del muco che a sua volta deve essere caratterizzato in termini di proprietà chimiche reologiche e diffusive. Inoltre la loro progettazione richiede un maggior numero di componenti in coltura, l’utilizzo di scaffold e di bioreattori da progettare ad hoc figurando un processo di sviluppo molto più complesso di quello necessario per la realizzazione di un modello di muco artificiale. Sulla base di queste considerazioni, si deduce che una caratterizzazione efficace di un farmaco che deve attraversare la barriera del muco debba necessariamente essere condotta impiegando più modelli, ciascuno dei quali mima un aspetto del muco nativo. Alla luce dell’analisi comparativa e della revisione critica dei risultati in termini di prove reologiche e diffusive ottenute dai vari autori e il confronto con i valori registrati nel muco nativo si indicano i modelli artificiali, composti da mucina purificata e ricostruita in soluzione con l’ulteriore aggiunta di proteine, lipidi e DNA, come i più promettenti. Questi sono in grado di simulare con sufficiente accuratezza le proprietà fisiche seppur a scapito della scarsa similarità in termini di anatomia con le strutture presenti in vivo. In particolare i risultati migliori in termini reologici sono forniti dal modello multicomponente in gel mentre i risultati migliori per le proprietà diffusive sono riscontrate nel modello multicomponente completo. Per l’ottenimento di un unico modello che combini le caratteristiche migliori di ciascuno, si potrebbe considerare un modello che preveda l’impiego di acido poliacrilico per simulare le proprietà reologiche come propone il modello multicomponente in gel e di una miscela di lipidi a concentrazione elevata per mimare le proprietà diffusive come suggerisce il modello multicomponente completo.