Conjugated polymer particles: a bidirectional strategy for light-biosystem interaction

In recent years, organic semiconductors arose as a class of materials for multifunctional applications. They have been widely used for photovoltaic, photodetection, light emission and photo-electrochemical applications thanks to their distinctive optoelectronic properties. More recently, conjugated polymer emerged as excellent materials also for biotechnology applications, due to their distinctive biocompatibility and mechanical properties. Furthermore, the possibility to exploit their optoelectronic properties made conjugated polymers ideal exogenous materials for optical modulation of living cells activity. Interestingly, conjugated polymers possess a carbon-based structure which closely resembles the chemical structure of retinal, a chromophore molecule contained in rhodopsin proteins, thus suggesting their use in the field of artificial vision. It has been recently reported that artificial retinal prosthesis using poly(3-hexylthiophene) (P3HT) as the light absorbing layer, implanted in the sub-retinal space of blind rats, are very well tolerated over several months and partially restore visual acuity in blind rats. Given the outstanding biotechnological potential of conjugated polymers, investigation on different nanoscaled architectures has been gaining considerable attention. The aim of this thesis dwells on a detailed study of the interaction between P3HT nanoparticles (P3HT-NPs) and living cell cultures, both from a physiological and photophysical perspective. P3HT-NPs fabrication consists in the application of the nano-precipitation method for obtaining surfactant-free suspensions with excellent colloidal stability. Through this process, it is possible to obtain NPs under sterile conditions with highly reproducible morphological properties, which are essential for biological applications. Morphological, physical and optoelectronic properties of NPs are characterized by a combination of different experimental techniques. Hydrodynamic diameter values and polydispersity indexes are obtained by Dynamic Light Scattering (DLS), while UV−VIS and fluorescence spectroscopy are used to confirm the preservation of optical properties of the pristine polymer. Scanning Electron Microscopy (SEM) highlights the well-defined spherical shape and smoothness of surface particles. Biocompatibility of P3HT-NPs is an issue of great relevance for in vitro and especially in vivo applications. Therefore, P3HT-NPs are incubated with Human Embryonic Kidney (HEK-293) cell cultures and their potential cytotoxicity is evaluated at first. A colorimetric assay, that assesses cell metabolic activity, demonstrates that cell proliferation after NPs incubation is not compromised. Along with this information, it is necessary to establish whether P3HT-NPs undergo internalization during cell incubation. Combined analysis of stained cell cultures with fluorescence and confocal imaging provides evidence about the localization of P3HT-NPs within the cell cytoplasm but outside the nuclear membrane. The effect of P3HT-NPs on cell functionality is then evaluated. Calcium ions are at the basis of intracellular signals, and pathological conditions of cells can be identified by observing dynamics of intracellular Ca2+ fluxes. No permanent alterations of the physiological cell activity are evidenced. Polymer NPs uptake may also impact on cell membrane electrical properties, such as resting membrane potential, capacitance and resistance. Their possible impact has been evaluated by electrophysiology experiments in voltage clamp configuration. Samples treated with P3HT-NPs do not show any statistical differences with control samples, meaning that NPs internalization does not significantly or persistently affect the lipid membrane main properties. In this thesis we are mainly interested in exploring new technologies for light-biomatter interaction, in particular we want to demonstrate the feasibility of inducing a cell bioelectrical response upon illumination, and the particle surface is the region that especially interacts with the environment. A new route can be explored by tailoring the active polymer with functional groups, like N-succinimidyl-ester (NHS) group, to selectively bind NPs to amine groups on membrane proteins. Thus, NHS-NPs are incubated with HEK-293 cells, and confocal microscopy confirms NPs docking on cell membranes even after 24 hours of incubation. By applying whole-cell current clamp under light illumination, we can successfully induce a significant depolarization in the cell membrane potential. We conjecture that the light-induced polarization of cell membrane can have a thermal origin combined with the effect due to the intimate contact between the material and the lipid membrane, even if other electrical or chemical effects cannot be excluded. P3HT photoluminescence (PL) has been largely studied for photovoltaic applications. In our case, it is important to investigate P3HT-NPs photophysical properties before and after plasma membrane crossing, in order to highlight a possible role of plasma proteins. Time-resolved photoluminescence (TRPL) uncovers peculiar features of NPs emission, in particular a low-energy PL shoulder that is no more visible in spectra of NPs internalized within the cell cytosol. We possibly ascribe this behavior to the presence of loosely bound chains protruding from the surface of the NPs and interacting with the intracellular environment. The absence of cytotoxic and physiological effects on cells together with the peculiar behavior of PL properties make P3HT-NPs suitable candidates for use as biological photoctuators. Finally, new perspectives over possible mechanisms at the basis of the cellular activity photo-modulation are presented, and potential implementation of NPs structure is suggested towards the realization of a new platform of organic nano-actuators capable to interact with living systems by means of light.

Recentemente, i semiconduttori organici si sono presentati come una classe di materiali dalle applicazioni multifunzionali. Essi sono stati ampiamente usati per applicazioni fotovoltaiche, di emissione di luce e fotoelettrochimiche grazie alle loro peculiari proprietà optoelettroniche. Recentemente, i polimeri coniugati sono emersi come materiali eccellenti anche per applicazione biotechnologiche, grazie alle loro peculiari proprietà di biocompatibilità e meccaniche. Inoltre la possibilità di sfruttare le loro proprietà optoelettroniche hanno reso i polimeri coniugati dei materiali esogeni ideali per la modulazione ottica dell’attività cellulare. E’ interessante notare che i polimeri coniugati possiedono una struttura a base di carbonio che richiama la struttura chimica del retinale, una cromoforo che contiene proteine di rodopsina, suggerendo così il loro uso nel campo della retina artificiale. Precedentemente è stato dimostrato che protesi per retina artificiale con poly(3-hexylthiophene) (P3HT) come materiale che assorbe la luce, impiantate nello spazio sub-retinale di ratti ciechi, sono molto ben tollerati su parecchi mesi e restituiscono parzialmente l’acuità visiva in ratti ciechi. Dato l’eccezionale potenziale biotecnologico dei polimeri coniugati, le ricerche su diverse nanoarchitetture hanno ottenuto una considerevole attenzione. Lo scopo di questa tesi risiede in uno studio dettagliato dell’interazione tra nanoparticelle di P3HT (P3HT-NPs) e colture cellulari vive, da un punto di vista sia fisiologico sia fotofisico. La fabbricazione delle P3HT-NPs consiste nell’applicazione del metodo di nanoprecipitazione per ottenere delle sospensioni senza surfattante con eccellente stabilità colloidale. Attraverso questo processo, è possibile ottenere NPs in condizioni sterili con proprietà morfologiche altamente riproducibili, che sono essenziali per le applicazioni biologiche. Le proprietà morfologiche, fisiche e optoelettroniche delle NPs sono caratterizzate da una combinazione di diverse tecniche sperimentali. I valori del diametro idrodinamico e gli indici di polidispersità sono ottenuti tramite Dynamic Light Scattering (DLS), mentre la spettroscopia UV-VIS e la fluorescenza sono usate per confermare la conservazione delle proprietà ottiche del polimero originale. La Microscopia a Scansione Elettronica (SEM) evidenzia la forma sferica ben definita e la regolarità delle superfici delle particelle. La biocompatibilità delle P3HT-NPs è una questione di grande rilevanza per le applicazioni in vitro e soprattutto in vivo. Perciò le P3HT-NPs sono incubate con colture cellulari di Human Embryonic Kidney (HEK-293) e la loro potenziale citotossicità è anzitutto valutata. Un saggio colorimetrico, che valuta l’attività metabolica cellulare, dimostra che la proliferazione cellulare dopo l’incubazione delle NPs non è compromessa. Insieme a questa informazione è necessario stabilire se le P3HT-NPs vengono internalizzate durante l’incubazione con le cellule. L’analisi combinata della fluorescenza dello staining di colture cellulari e l’imaging confocale forniscono evidenza riguardo alla localizzazione delle P3HT-NPs all’interno del citoplasma cellulare ma fuori dalla membrana nucleare. Gli effetti delle P3HT-NPs sulla funzionalità cellulare sono quindi valutate. Gli ioni di calcio Ca2+ sono alla base dei segnali intracellulari, a condizioni patologiche del funzionamento cellulare possono essere identificate tramite l’osservazione delle dinamiche dei flussi intracellulari di calcio. Non si sono evidenziate alterazioni permanenti dell’attività fisiologica cellulare. L’assorbimento di NPs polimeriche può influenzare le proprietà elettriche della membrana cellulare, come il potenziale a riposo della membrana, la capacità e la resistenza. Il possibile impatto è stato valutato tramite esperimenti di elettrofisiologia nella configurazione voltage clamp. I campioni trattati con P3HT-NPs non mostrano nessuna differenza statistica con i campioni di controllo, significando che l’internalizzazione delle NPs non influisce in maniera persistente sulle proprietà della membrana lipidica. In questa tesi siamo soprattutto interessati a esplorare nuove tecnologie per l’interazione tra luce e sistemi biologici, in particolare vogliamo dimostrare la possibilità di indurre una risposta cellulare elettrica sotto illuminazione, e la superficie della particella è la regione che interagisce particolarmente con l’ambiente esterno. Una nuova strada può essere esplorata creando un polimero attivo con gruppi funzionali, come il gruppo estere N-succinimmide (NHS), al fine di legare selettivamente le NPs ai gruppi amminici presenti sulle proteine di membrana. Così, le NHS-NPs sono state incubate con le cellule HEK-293, e la microscopia confocale ha confermato l’ancoraggio delle NPs sulla membrana cellulare fino a 24 ore dall’incubazione. Tramite esprimenti di current clamp sotto illuminazione è stato possibile indurre consuccesso un cambiamento significativo nel potenziale di membrana. Abbiamo ipotizzato che la polarizzazione della membrana cellulare indotta dalla membrana può avere un’origine termica combinata con l’effetto dovuto all’intimo contatto con il materiale e la membrana lipidica, anche se altri effetti elettrici e chimici non possono essere esclusi. La fotoluminescenza del P3HT è stata ampiamente studiata per applicazioni fotovoltaiche. Nel nostro caso è importante investigare le proprietà fotofisiche delle nanoparticelle prima e dopo l’attraversamento della membrana plasmatica, per evidenziare una possibile influenza delle proteine di membrana. La fotoluminescenza risolta nel tempo (TRPL) scopre caratteristiche particolari dell’emissione delle nanoparticelle, in particolare una spalla di PL a bassa energia non è più visibile negli spettri delle NPs internalizzate nel citosol della cellula. Abbiamo ascritto il comportamento alla presenza di catene non strettamente legate tra loro e che sporgono dalla superficie delle NPs e interagiscono con l’ambiente intracellulare. L’assenza di effetti citotossici e fisiologici sul funzionamento cellulare insieme al peculiare comportamento delle proprietà di PL rendono le P3HT-NPs un candidato adatto per l’utilizzo come sonda biologica. Infine, nuove prospettive sui possibili meccanismi alla base della fotostimolazione dell’attività cellulare sono presentati, e una potenziale implementazione della struttura delle NPs è suggerità al fine di realizzare una nuova piattaforma di nanoattuatori organici capaci di interagire con i sistemi viventi per mezzo della luce.