Chemo-enzymatic depolymerization of lignins

The experimental work performed in these three years of PhD, locates within the broad field of lignin valorization studies. Lignin represents more than 30 % (by weight) of the total biomass of the earth biosphere and it is one of the three major subcomponents of lignocellulosic biomass. Although burning lignin still represents a valuable contribution for saving fossil sources, lignin also offers perspectives in terms of higher value-added applications. In fact, after the hydrolysis of lignocellulose polysaccharides, lignin remains as a solid residue, representing one of the major renewable sources for biofuels and fine chemicals (mainly aromatics) production. The main limitation to practical applications for lignin so far is presumably due to the difficult and challenging processing for depolymerisation and valorisation. In this respect, the challenge is to combine chemical and enzymatic methods in order to obtain selective cleavages of the polymeric skeleton. The work of my PhD is inserted in the context of the Valor Plus European Project “Valorisation of biorefinery by-products leading to closed loop systems with improved economic and environmental performance” (FP7 EC-KBBE-CALL-7 grant agreement FP6-KBBE-2013-7-613802 (2013-2017)) that aims to set-up a chemo-enzymatic process for the controlled depolymerisation and transformation of standard lignin feedstocks to value product streams. The work accomplished in this PhD project is divided into three main sections:  Part A: The Lig enzymatic system  Part B: Lignin fractionation  Part C: Lignin depolymerization At first, I studied the Lig enzymatic system (see Part A), which is able to cleave the β-O-4 aryl ether linkage, which represents about 50 % of all ethers in various lignins. The cleavage of this type of bond was identified to be part of lignin catabolism in the proteobacterium Sphingobium sp. SYK-5. Five enzymes were identified as being involved in this degradation process: LigD/L (Cα-dehydrogenases), LigF/E (β-etherases) and LigG (glutathione lyase). The activity of these recombinant enzymes obtained in our laboratory “The Protein Factory” has been tested on the lignin dimeric model compound 1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-(2-methoxyphenoxy)-1,3-propanediol as substrate, proving that this enzymatic system is able to efficiently cleave and process this type of chemical bond in the presence of NAD+ and glutathione. Kinetic studies on the model compound have been performed and the whole process has been optimized.[1] In parallel to this project, a tool box of enzymes composed of many different classes of enzymes aiming to perform selective transformation of lignin functionalities has been built including commercial enzymes, recombinant enzymes and enzymes obtained through a metagenomics approach. The preliminary unsuccessful results obtained when the unmodified raw material (ProtobindTM1000 provided by the technical manager of the Valor Plus Project) has been incubated with different enzymes indicated that the enzymatic biotransformations required a more homogeneous starting material. The development of a pre-treatment strategy became necessary (see Part B) to separate the small molecules from the bulky material before carrying out other tests. The first approach has been the dialysis of raw lignin in order to obtain two different fractions, a retentate rich in high molecular weight molecules, and a permeate enriched in small compounds. A further step towards a physical separation in terms of molecular weight has been performed in collaboration with Biobasic Environnement (Saint-Beauzire, France), an industrial partner of the European Project Valor Plus. Two different approaches have been developed. The first method involved a microfiltration followed by two ultrafiltration steps on a starting solution of ProtobindTM1000 in ethanol/basic water. The process has been set-up with two different sets of membranes (membrane in polyethersulfone with a cut-off of 3 kDa and 1 kDa and membranes in stabilized cellulose with a cut-off of 5 kDa and 2 kDa). The second method consisted of a soxhlet extraction of a solution of ProtobindTM1000 in methyl ethyl ketone (2-butanone, MEK) followed by two ultrafiltration steps using stabilized cellulose based membranes with a cut-off of 5 kDa and 2 kDa. This second method has also been applied to another industrial lignin (Kraft). All the different fractions obtained from these sequential ultra-filtrations had been fully characterized by GPC, GC-MS, ESI-MS, DSC, TGA, GFC and HPLC. Unfortunately, when these more homogeneous fractions (see Part C) have been incubated directly with different enzymes, no degradation has been identified. Probably, this was because these polymers were too bulky to be efficiently attacked and modified by the protein activity, and therefore a new approach has been developed based on a two-step cascade process. The rationale behind this approach was that a first oxidation step (which could be chemical or photochemical) was required to partially cleave and oxidize the polymeric skeleton in order to make it more accessible to the enzymatic activity. Therefore, I started to focus on the optimization of the parameters concerning the chemical degradation approaches, arriving to the conclusion that the best results have been obtained when the samples have been treated with NaBr, NaClO, and TEMPO. However, the chemical approach is always linked to the use of harsh conditions, solvents to extract the products and expensive catalysts. On the other hand the use of a photochemical path is very appealing as it would be a greener alternative since it relies on UV light to catalyze the depolymerization. The photocatalytic step therefore exploits the oxidation capability of UV-irradiated ZnO nanoparticles in order to establish a water based greener oxidative pathway. The photochemical degradation tests provided quite promising results, as the GPC analysis indicated a clear reduction of both Mn (number-average molecular weight) and PDI (polydispersity index). These partially degraded products obtained both from the first photochemical and chemical oxidations have then been tested as substrates for different enzymatic bioconversions. Different commercial laccases: LAC 3 from Trametes spec., LAC C from Trametes versicolor and LAC F from Funalia trogii provided by ASA Spezialenzyme partner of the Valor Plus Project have been assayed. The time course experiments performed on all three enzymes highlighted the best operative conditions for the bioconversions. The cascade process indeed leads to a clear reduction of the Mn and Mw values, even if the total yields in terms of mass recovery of the two-step process on 1 g scale in each case does not exceed 20 %. Further studies are now in progress for the optimization of the whole process for the application in a pilot plant. [1] Rosini, E.; Allegretti, C.; Melis, R.; Cerioli, L.; Conti, G.; Pollegioni, L.; D'Arrigo, P. Catalysis Science and Technology, 2016, 6, 2195-2205.

Il lavoro sperimentale condotto in questi tre anni di dottorato è inserito nel vasto ambito inerente agli studi sulla valorizzazione della lignina. Essa rappresenta più del 30 % (in peso) della biomassa terrestre, ed è uno dei tre componenti principali che costituisce la biomassa lignocellulosica. Sebbene l'utilizzo della lignina come fonte combustibile sia considerata ancora oggi come una valida alternativa per salvare i combustibili fossili, la stessa offre inoltre interessanti prospettive in termini di applicazioni ad alto valore aggiunto. Di norma, dopo l'idrolisi dei polisaccaridi della lignocellulosa, la lignina rimane come residuo solido, ed è considerata una delle maggiori fonti rinnovabili per quanto riguarda la produzione di biocarburanti e di prodotti chimici fini (di natura aromatica). Il grosso limite associato all'utilizzo pratico di questa fonte è legata alle difficoltà riscontrate nei processi di depolimerizzazione e valorizzazione. A questo proposito, la sfida è di riuscire a combinare processi chimici ed enzimatici capaci di eseguire delle scissioni selettive dello scheletro polimerico. Il mio progetto di tesi è inserito nel contesto del Valor Plus European Project dal titolo "Valorisation of biorefining by-products leading to closed loop systems with improved economic and environmental performance" (FP 7 EC-KBBE-CALL-7 grant agreement FP6-KBBE-2013-7-613802 (2013-2017)) che ha come obbiettivo lo sviluppo di processi chemo-enzimatici per la depolimerizzazione e trasformazione controllata di materia prima lignocellulosica a prodotti ad alto valore aggiunto. Il lavoro effettuato durante il mio progetto di tesi è diviso in tre sezioni: • Parte A: Il sistema enzimatico Lig • Parte B: Il frazionamento della lignina • Parte C: Depolimerizzazione della lignina Nella prima sezione (Parte A) ho riportato i risultati ottenuti studiando il sistema multienzimatico Lig. Questo sistema è in grado di scindere il legame etereo β-O-4, che costituisce uno dei legami più abbondanti nelle varie lignine (fino al 50 %). Questa azione è stata identificata essere parte del catabolismo del proteobacterium Sphingobium sp.SYK-5. Cinque enzimi sono stati indentificati a prendere parte di questo processo: LigD/L (Cα deidrogenasi), LigF/E (β-eterasi), e LigG (glutatione liasi). L'attività di questi enzimi ricombinanti ottenuti nel laboratorio "The Protein Factory", è stata provata utilizzando come substrato un modello dimerico della lignina 1-(4-idrossi-3-metossifenil)-2-(2-metossifenossi)-1,3-propandiolo, dimostrando che questa sistema enzimatico è in grado di scindere efficacemente il legame etereo, in presenza di NAD+ e glutatione. Studi di cinetica sul composto modello sono stati effettuati , e l'intero processo è stato ottimizzato.[1] In parallelo sono stati raggruppati diverse classi di enzimi in grado di effettuare specifiche trasformazioni su varie funzionalità della lignina, includendo enzimi commerciali, ricombinanti e proteine ottenute attraverso processi metagenomici. I primi risultati poco promettenti riscontrati quando la lignina grezza (ProtobindTM1000 fornita del direttore tecnico del progetto Valor Plus) è stata incubata con diversi enzimi hanno indicato che le biotrasformazioni enzimatiche necessitano di un materiale di partenza molto più omogeneo. Lo sviluppo di processi di pretrattamento del materiale grezzo (Parte B) è diventato necessario per poter separare le molecole piccole dai polimeri ingombranti e poter svolgere le nostre prove. Il primo approccio utilizzato è stata la dialisi, mirando a ottenere due diverse frazioni, un retentato ricco di molecole ad alto peso molecolare e un permeato costituito da piccoli composti. Un ulteriore passo verso una separazione fisica in termini di peso molecolare è stata sviluppata in collaborazione con Biobasic Environnement (Saint-Beausire, France), un partner industriale del progetto Valor Plus. Due diversi approcci sono stati sviluppati, il primo vede prima un passaggio di microfiltrazione seguito da due ultrafiltrazioni di una soluzione iniziale di ProtobindTM1000 in etanolo/acqua basica. Il processo è stato sviluppato usando due diverse tipologie di membrane; membrane in polietersulfone con un cut-off di 3 kDa e 1 kDa e membrane in cellulosa stabilizzata con cut-off di 5 kDa e 2 kDa. Il secondo metodo invece prevede una prima estrazione della ProtobindTM1000 a caldo con solvente (2-butanone, MEK) seguita da due ultrafiltrazioni usando le membrane di cellulosa stabilizzata con cut-off da 5 kDa e 2 kDa. Questo secondo metodo è stato applicato anche a un'altra lignina commerciale (Kraft). Tutte le frazioni ottenute delle ultrafiltrazioni sono state caratterizzate completamente tramite GPC, GC-MS, ESI-MS, DSC, TGA, GFC e HPLC. Sfortunatamente, quando queste frazioni più omogenee sono state incubate direttamente con gli enzimi, nessuna degradazione è stata individuata. Probabilmente questo è dovuto alla natura troppo ingombrata dei polimeri, che li rendono poco aggredibili dagli enzimi, ed è per questo che un nuovo processo a due stadi è stato studiato. La razionale dietro questa scelta è che un primo attacco ossidativo ( chimico o fotochimico) è necessario per degradare parzialmente e ossidare lo scheletro polimerico, per renderlo più accessibile alla successiva azione enzimatica. Molta attenzione è stata rivolta alla ottimizzazione dei parametri relativi al primo stadio di ossidazione chimica, i risultati migliori sono stati ottenuti quando la lignina è stata trattata con NaBr, NaClO e TEMPO. Tuttavia questo approccio chimico è sempre legato all'utilizzo di condizioni rigide, solventi per le estrazioni e catalizzatori costosi. Più interessante invece è l'utilizzo di un approccio fotochimico, visto che presenta una alternativa molto più "green" basandosi sulla luce UV per catalizzare la depolimerizzazione. Questo stadio ossidativo quindi sfrutta la capacità ossidativa di nanoparticelle di ZnO, irradiate con luce UV per effettuare ossidazioni della lignina in soluzioni acquose. Queste prove hanno portato a ottenere risultati promettenti, visto che le analisi GPC hanno indicato un chiara riduzione dei valori di Mn (massa molare media) e PDI (indice di polidispersità). I campioni parzialmente degradati ottenuti sia dal trattamento chimico che da quello fotochimico sono stati utilizzati come substrati per differenti bioconversioni enzimatiche. Diverse laccasi commerciali quali: LAC 3 da Trametes spec., LAC C da Trametes versicolor, e LAC F da Funalia trogii, fornite da ASA Specialenzyme (partner del progetto Valor Plus) sono state utilizzate. Delle prove di attività in relazione al tempo di incubazione sono state effettuate, per poter individuare le migliori condizioni operative da utilizzare per le bioconversioni. Il processo a due stadi è risultato essere abbastanza efficace in quanto fornisce dei prodotti con valori di massa molecolare molto ridotta, ma presenta una resa di recupero molto in quanto non supera il 20 %. Ulteriori studi sono ora in corso per riuscire a ottimizzare l'intero processo per poi poterlo applicare su un impianto pilota. [1] Rosini, E.; Allegretti, C.; Melis, R.; Cerioli, L.; Conti, G.; Pollegioni, L.; D'Arrigo, P. Catalysis Science and Technology, 2016, 6, 2195-2205.