Design and synthesis of lipid-based/PEGylated nanocarriers for targeted delivery of proteins and nucleic acids

This thesis work focused on the design and synthesis of nanoparticles that can be used as carriers for the encapsulation and targeted delivery of therapeutic macromolecules, such as proteins and nucleic acids. The goal of drug delivery is to increase the blood circulation half-life, the maximal tolerated dose and the selectivity of the treatments with respect to conventional medicine. In this study, depending on the application, different physical and chemical nanocarriers properties were chosen in order to accomplish the drug delivery at specific sites with the maximum efficiency. Firstly, a targeted therapy based on the formulation of engineered PEGylated liposomes loaded with Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) was developed for the treatment of damaged glomeruli in kidneys. These liposomes were able to effectively encapsulate this therapeutic protein and release it in the proximity of glomerular tissues, thanks to the selectivity assured by the conjugated peptides. In vivo experiments were performed to analyze the target efficiencies and the therapeutic activity of the drug-loaded liposomes, as well as the impact of the complexes on the mortality of the subjects. Secondly, another therapy associated with the same glomerular disease was developed based on the site-specific PEGylation of BDNF. This application improves the effectiveness of the protein drug because it increases the retention time in the body and its stability. The functionalization was performed by coupling the terminal amino group of the protein with the aldehyde group of poly(ethylene glycol) (PEG). Then, a purification process was performed to attempt the isolation of the product of interest, which is the one that assures the right functionalization of the protein and minimize its denaturation and degradation. Both these strategies may represent interesting procedures for the effective treatment of damaged podocytes which are involved in many glomerular diseases. Finally, a specific gene delivery mechanism was studied to develop a new immunotherapy to treat neuroblastoma. A cationic liposome formulation was associated with the p65 plasmid able to interfere with the immune response of the tumor cells. These specific engineered liposomes, eventually conjugated with PEG and targeting ligands, offer the potential for delivering genetic material directly to brain cancer cells, thus improving the desired therapeutic effects.

Il lavoro di questa tesi è stato incentrato sulla progettazione e sintesi di nanoparticelle capaci di fungere da vettori per l’incapsulamento e il trasporto di farmaci macromolecolari, come proteine e acidi nucleici. Lo scopo del drug delivery è infatti quello di incrementare l’emivita del farmaco, la massima dose tollerata e la selettività del trattamento rispetto alla medicina tradizionale. In questo studio, a seconda delle applicazioni, sono state selezionate le proprietà chimico-fisiche dei nanovettori per portate a termine il rilascio del farmaco nel sito d’interesse con la massima efficienza. In primo luogo, è stata sviluppata una terapia mirata al trattamento di glomeruli renali danneggiati con l’utilizzo di Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) incapsulato in liposomi PEGilati e ingegnerizzati. Questi liposomi sono stati capaci di incapsulare la proteina e rilasciarla in prossimità del tessuto glomerulare, grazie alla coniugazione con peptidi selettivi. A questo scopo, alcuni esperimenti in vivo sono stati realizzati per analizzare l’efficienza di targeting e l’attività terapeutica della proteina incapsulata nei liposomi, oltre che l’impatto di quest’ultimi sulla mortalità dei soggetti. Successivamente, sempre relativamente alla stessa malattia glomerulare, è stata realizzata un’altra terapia basata sulla PEGilazione di BDNF. Questa applicazione migliora l’efficacia del farmaco proteico, poiché ne aumenta il tempo di ritenzione e la stabilità. La funzionalizzazione è stata eseguita accoppiando il gruppo amminico terminale della proteina con l’aldeide terminale del poly(ethylene glycol) (PEG). Poi, tramite un processo di purificazione è stato tentato l’isolamento del prodotto d’interesse, ovvero quel complesso che assicura il buon funzionamento della proteina minimizzandone la denaturazione e degradazione. Entrambe le strategie sopracitate rappresentano un’interessante procedimento per il trattamento dei podociti coinvolti in malattie glomerulari. Infine, per sviluppare una nuova immunoterapia rivolta alla cura del neuroblastoma, è stato studiato un particolare sistema di trasporto e rilascio di materiale genico. Il plasmide p65 in grado di attivare la risposta immunitaria delle cellule tumorali è stato coniugato a una formulazione di liposomi cationici. Questi liposomi ingegnerizzati, eventualmente funzionalizzati con PEG e ligandi specifici, offrono un grande potenziale in termini di rilascio di materiale genico direttamente all’interno delle cellule tumorali del cervello, e quindi di miglioramento degli effetti terapeutici desiderati.