Conditioned behaviour in juvenile zebrafish : a novel setup towards the in-vivo exploration of the neural mechanism of learning

The cognitive capabilities of fish have historically been underestimated and, in many respects, they are comparable to birds and mammals. Currently, an increasing number of behavioural neuroscience laboratories have started using zebrafish as their main animal model. Although the zebrafish brain is substantially more primitive than that of mammals, basic brain anatomy is highly conserved across vertebrates. Furthermore, fish have a sophisticated behavioural repertoire that can allow quantification of functional changes in the brain induced by environmental manipulations. Zebrafish have been mostly used so far in developmental biology, genetics, pharmacology and toxicology. Currently, researchers are extending their use in behavioural neuroscience, focusing in particular on early developmental stages (one to three weeks old). At this developmental stage, their small size and transparency allows single and multi-photon imaging in order to visualize the brain activity. However, investigation on associative conditioning in larvae/juvenile zebrafish is limited and the mechanism remains poorly understood. Historically, most of the behaviour studies relied on manual quantification of fish behaviour, which is sensitive to human errors. To achieve a reproducible and high throughput quantification of fish behaviour, fundamental in behavioural studies, a fully automated setup is required. The aim of this master thesis is to develop hardware and software for a setup that allows monitoring and quantification of zebrafish behaviour during active avoidance conditioning assays. In order to establish this learning protocol, I first assembled a microcontroller based hardware platform and later used the C++ language to implement multi-threaded software able to track simultaneously the position of six fish in real time. The real time tracking allowed me to administer an aversive stimulus to individual animals based on their position. Using this setup, I have tested the learning response of three groups of zebrafish, from one to three weeks old. My results indicate that zebrafish can perform active avoidance already at the one-week-old larval stage and that this type of learning becomes very robust around the third week of development. The learning performance of animals improves across developmental stages, resulting in a faster and more stable acquisition of conditioned behaviour. Moreover, thanks to the high spatial and temporal resolution in the quantification of fish behaviour, I had the possibility of investigating how parameters such as baseline swim pattern, average velocity and thigmotaxis index correlate with the learning performance of the fish. The setup developed in this master thesis proposes a systematic and fully automated approach for the investigation of zebrafish behaviour.

Le facoltà cognitive dei pesci sono state storicamente sottostimate, ma sotto molti punti di vista sono comparabili a quelle di mammiferi. Attualmente, sempre più laboratori incentrati sullo sudio delle neuroscienze del comportamento scelgono come modello animale il danio zebrato (“zebrafish”) dal momento che l’anatomia base del cervello, pur risultando più primitiva di quella dei mammiferi, è preservata nei teleosti. Inoltre, i pesci hanno un repertorio comportamentale sofisticato che può consentire la quantificazione di cambiamenti funzionali nella connettività neurale indotti da manipolazioni ambientali. Gli zebrafish sono stati utilizzati per lo studio della biologia dello sviluppo del sistema nervoso centrale, in genetica, in farmacologia e in tossicologia. Attualmente, i ricercatori stanno estendendo il loro uso nelle neuroscienze comportamentali, concentrandosi in particolare sui primi stadi dello sviluppo (dalla prima alla terza settimana). Durante questa fase di sviluppo, gli zebrafish hanno dimensioni ridotte e il loro essere trasparenti consente la visualizzazione dell’attività neurale tramite microscopia a singolo e multi-fotone. Tuttavia, le indagini sul comportamento condizionao negli zebrafish durante i primi stadi di sviluppo sono limitate e i circuiti neurali implicati poco compresi. Storicamente, la maggior parte degli studi comportamentali si basavano su una quantificazione manuale, che è però soggetta ad errori umani. Per ottenere una quantificazione riproducibile e ad alta numerosità del comportamento degli zebrafish, approccio fondamentale negli studi comportamentali, è necessario un approccio completamente automatizzato. Lo scopo di questa tesi è lo sviluppo di hardware e software per implementare una configurazione sperimentale che consenta il monitoraggio e la quantificazione del comportamento di zebrafish durante un protocollo di condizionamento. Ho quindi assemblato una piattaforma hardware dove un monitor LED viene utilizzato per presentare stimoli visivi ed un microcontrollore viene utilizzato per somministrare stimoli agli animali e, utilizzando il linguaggio di programmazione C++, ho implementato un software multi-thread in grado di tracciare in tempo reale la posizione di sei pesci simultaneamente. Usando questa configurazione, ho testato l’apprendimento di tre gruppi di zebrafish, dalla prima alla terza settimane di sviluppo. I miei risultati indicano che gli zebrafish già allo stadio di larva (prima settimana di sviluppo) possono associare una valenza negativa ad una determinata porzione dell’arena. Questa associazione migliora durante lo sviluppo, con il risultato di un'acquisizione sempre più rapida e stabile della risposta condizionata. La configurazione sviluppata in questa tesi di laurea propone un approccio sistematico e automatizzato per il monitoraggio e la quantificazione del comportamento di zebrafish.