3D printed flow-focusing nozzle for encapsulation of intestinal organoids

This work discusses the development of a 3D printed flow-focusing nozzle for the encapsulation of intestinal stem cells, and furthermore intestinal organoids. The concentric flow of the nozzle was modeled to create a double-encapsulation droplet containing intestinal organoids in a cell medium suspension, surrounded by an alginate hydrogel capsule. Prints containing microchannels were fabricated successfully but multiple difficulties were experienced with print quality. Outlet nozzle rims were often damaged due to the need for residual resin removal, and surface roughness of the internal channels created complications for robust droplet formation. Selective laser-induced etching (SLE) was also investigated as an alternative modality for nozzle fabrication. Despite printing difficulties, spherical capsule formation was accomplished with the use of jet-inducing flow rates, albeit with low efficacy (5-10%). Capsule formation was confirmed with a fluorescently-labelled shell and confocal fluorescence imaging. Subsidiary experiments were performed with intestinal organoids encapsulated in solid alginate-Matrigel beads. The encapsulated cysts were maintained and sustained in culture, but did not actively mature to create budding organoid structures.

Introduzione Un modello di studio che ultimamente è diventato di particolare interesse è senza dubbio l'utilizzo in vitro di organoidi. Essi vengono fatti derivare da cellule staminali e consistono in un tessuti similari ai corrispondenti organi adulti. Un organoide è composto da più tipi di cellule, ma inizialmente è costituito da un’unica cellula staminale che cresce progressivamente; essi forniscono un prezioso strumento per gli studi in vivo e conferiscono il potenziale per sviluppare analisi ad alto rendimento e metodi di esaminazione cellulare. Infatti, questi studi possono fornire informazioni sui fenomeni embriologici, possono essere utilizzati per creare modelli di malattie in vitro oppure possono essere utilizzati per eseguire analisi farmacologiche o per molte altri ambiti riguardanti la medicina rigenerativa. L'organo di riferimento in questo studio, e quindi il tipo di organoide, è l'intestino. Gli organoidi intestinali sono coltivati in culture cellulari 3D, organizzandosi in un epitelio polarizzato. Le loro strutture possiedono rami germogliatori di cellule che sporgono dal lume centrale, il quale ricorda la cripta del tessuto intestinale maturo. In questo studio, gli organoidi sono derivati da tessuto murino primario, topi Lgr5-eGFP-ires-CreERT2. La mutazione genetica del locus Lgr5 ha permesso il monitoraggio delle cellule staminali in vita, sia durante gli esperimenti che durante gli studi. I recenti studi biongegneristici si sono focalizzati nell’incapsulare le cellule in capsule di microgeli. Questo approccio colturale offre una piattaforma interessante per sperimentare l'incapsulamento di organoidi. Molti metodi sono stati ideati sia per la fabbricazione di droplet microfluidic device, sia per quella di microgeli, insieme e non. Entrambi i metodi si pongono come obiettivo finale l'incapsulamento cellulare. Questi incapsulamenti micro-cellulari hanno la capacità di creare un microambiente simile a quello di un bioreattore e possono essere utilizzati per l'isolamento e la separazione di cellule o gruppi di esse, per la manipolazione delle stesse, per misurare la fattibilità di co-colture, per il rilascio programmatico di farmaci ed innumerevoli altri scopi. Sarebbe interessante ampliare la ricerca attuale per progettare un metodo più efficiente ed ad alta velocità di incapsulamento di cellule ed organoidi. Questo lavoro tratta dello sviluppo di un ugello di focalizzazione del flusso stampato in 3D per l'incapsulamento di cellule staminali, e quindi di organoidi, intestinali. Il flusso concentrico dell'ugello è stato modellato per creare una doppia incapsulazione. Lo scopo finale è quello di ottenere una droplet contenente organoidi intestinali in una sospensione di medium cellulare, circondata da una capsula di idrogelo alginato. Materiali e metodi L'ugello di focalizzazione di flusso utilizzato per il doppio incapsulamento delle droplets è stato progettato tramite Fusion 360 di Autodesk. Il design prevede tre canali: un primo è dedicato alle cellule e al mezzo, il secondo è all'idrogel di alginato e, infine, un canale intermedio ha il compito di mantenere le cellule e l'idrogel inizialmente separati. Le stampe sono state realizzate tramite EnvisionTEC 4 Mini XL con la resina plastica termoindurente acrilica HTM140 (Perfactory, EnvisionTEC). Prima della sperimentazione, tutti i modelli sono stati rivestiti in Parylene, al fine di diminuire la permeabilità del materiale dell'ugello. Sono state utilizzate tre semplici pompe a siringa (NEM-B101-02E, neMISTE) per controllare le portate entranti nell'ugello; le portate sono state variate a seconda del risultato sperimentale desiderato. La gelificazione dell'alginato di sodio è stata eseguita a contatto con catione bivalente, Ca2 +, preparato tramite un bagno di calcio dal quale le droplets sono state raccolte. Le droplets solidificate sono state lavate e poste in condizioni di coltura cellulare standard, immerse in un mezzo di formazione di organoidi. Le colture hanno avuto la durata di otto giorni, durante i quali le capsule cellulari sono state monitorate. L'imaging delle capsule è stato poi eseguito con microscopia sia a campo chiaro sia confocale. Risultati Diverse variazioni geometriche dell'ugello sono state realizzate mediante stampa 3D per ottenere una focalizzazione ottimale del flusso. Tuttavia, la rugosità superficiale dei canali interni ha creato difficoltà nell’ottenimento di microsfere con un comportamento robusto e riproducibile, infatti i bordi dell'ugello sono stati spesso danneggiati a causa della necessità di rimuovere la resina residua dopo la stampa. Per ovviare questo problema, punte di Teflon sono state aggiunte all’interno degli ugelli per ottenere un diametro interno più liscio, nonché una diminuzione delle interazioni liquido-materiale. Il software di fluidodinamica computazionale (Autodesk CFD) è stato utilizzato per calcolare e perfezionare i profili di flusso all'interno degli ugelli stampati. I risultanti numeri di Reynolds variano da 0.05 a 186, a seconda dei parametri di simulazione; tuttavia il flusso rimane laminare per tutte le simulazioni. La formazione di capsule è stata confermata mediante un marker fluorescente dell’alginato e imaging con microscopio confocale in fluorescenza, ciò nonostante l'efficacia del metodo è inferiore al 5%. Gli organoidi intestinali sono stati coltivati in microsfere di alginato e Matrigel per una durata di sette giorni. Le cisti intestinali sono state mantenute in coltura, ma non sono maturate attivamente per creare strutture organoidi germogliate. Conclusione e sviluppi futuri Nel lavoro qui discusso, è stato implementato con successo un sistema microfluidico per la produzione di gocce. Tuttavia, tale sistema risulta essere caratterizzato da una bassa efficienza nel caso di doppia incapsulazione. La maggior causa di insuccesso è da imputare alla tecnica di stampa 3D utilizzata per la produzione del dispositivo microfluidico, essendo che questa tecnica non è risultata appropriata per la realizzazione di canali di dimensione micrometrica. Essa, infatti, crea delle superfici altamente rugose che danneggiano la superficie stessa dell’orifizio quando i residui di stampa vengono rimossi; questo influenza drammaticamente la produzione delle gocce. In alternativa, è stato realizzato un ago con la tecnica di selective laser- induced etching (SLE), utilizzando le stesse considerazioni progettuali impiegate per la fabbricazione del sistema microfluidico con la tecnica di stampa 3D. La SLE ha dimostrato di saper generare delle superfici più lisce e in generale, un dispositivo con applicazioni di livello superiore nel campo della microfluidica. Tuttavia, il dispositivo realizzato con questa tecnica non è stato consegnato in tempo da permettere di finire questo lavoro di tesi. In seguito ai miglioramenti nella produzione di gocce, le cellule potranno essere incapsulate in condizioni più ottimali per la maturazione e per il differenziamento di organoidi. Negli esperimenti futuri, attuatori meccanici e induttori di voltaggio potrebbero essere potenzialmente implementati per migliorare l’efficienza della formazione di gocce e ridurre l’agglomerazione di queste alla fine del processo.