Targeting glioblastoma cells by doxorubicin-loaded PLGA-PEG nanocarriers

Glioblastoma multiforme (GBM) is a very aggressive brain tumor and its eradication is profoundly difficult. The integrity of the BBB that characterizes the most peripheral regions of the tumor limits the amount of chemotherapeutic drugs that reach glioblastoma cells in these areas, leading to the inevitable recidivism even after surgery. The use of engineered polymer nanocarriers as drug delivery system combined with radiotherapy (RT) has been proposed in nanomedicine to overcome limitations of currently chemotherapy. Tamborini and collaborators at the Humanitas institute, demonstrated that low doses of radiation make BBB more permeable without altering the width of the extra cellular space and the distance between astrocytes and pericytes cells. This allows nanoparticles with diameters higher than 100 nm to overcome BBB without be transported into the central nervous system, limiting damage to healthy tissues. In this work, new engineered polymeric nanoparticles (NPs) were developed to penetrate glioblastoma tumors and selectively release a chemotherapeutic agent, in order to treat GBM effectively. Biocompatible and biodegradable PLGA-PEG nanoparticles, loaded with doxorubicin (i.e a standard, cost effective, and easily traceable chemotherapic drug) were functionalized with a targeting peptide. In particular, an activatable low molecular weight protamine (ALMWP) peptide was selected for conjugation because it can be activated only where matrix metalloproteinases (MMPs) are overexpressed, such as in glioblastoma microenvironments. The PLGA-PEG polymer precursor was firstly synthesized by carbodiimide chemistry from commercial PLGA and NH2-PEG-COOH, and the resulting copolymer was further functionalized with a maleimide group, to obtain a PLGA-PEG-MALE polymer. Stealth nanocarriers with size > 100nm were obtained by a standard nanoprecipitation method. In order to functionalise the nanocarriers with the activatable peptide ALMWP, PLGA-PEG-MALE nanoparticles were conjugated with a cysteine-terminated ALMWP through a Micheal-type-addition under physiological pH, resulting in PLGA-PEG-MALE-ALMWP nanocarriers. Doxorubicin (DOXO) was finally encapsulated by nanoprecipitation. Taking into account the effects caused by low doses of RT on the BBB, ALMWP-NPs larger than 100 nm should show high selectivity for peripheral GBM cells. Preliminary in vitro biological tests were set up to evaluate cytotoxicity and uptake of the nanoparticles by glioblastoma cells and they were carried out by the PhD student Marco Pizzocri at Humanitas Research Hospital, under the supervision of Dr. Lorena Passoni, in the research group headed by Prof. Michela Matteoli. The tests confirmed that the overexpression of MMPs by the tumor cells enhance nanoparticle internalization and the cytotoxicity of the encapsulated DOXO. These results, if confirmed by further in vivo study, may pave the way for developing new effective nanotherapeutics against glioblastoma multiforme.

Il glioblastoma multiforme (GBM) è un tumore del cervello molto aggressivo e la sua eradicazione è profondamente difficile. L’integrità della barriera emato-encefalica (BEE) che caratterizza le regioni più periferiche del tumore limita la quantità di farmaci chemioterapici che raggiungono le cellule di glioblastoma in queste zone, portando alla sua recidività anche in seguito ad un intervento chirurgico. L'uso di nanovettori polimerici ingegnerizzati come sistema di somministrazione di farmaci combinato con radioterapia (RT) è stato proposto in nanomedicina per superare i limiti della chemioterapia attuale. Tamborini e collaboratori, presso l’istituto Humanitas, hanno dimostrato che basse dosi di radiazioni rendono maggiormente permeabile la BEE senza tuttavia alterare la dimensione dello spazio extra cellulare e la distanza tra astrociti e periciti. Questo consente a nanoparticelle di diametro maggiore di 100 nm di superare la BEE senza però raggiungere tessuti sani del sistema nervoso centrale, limitando così gli effetti collaterali. In questo lavoro di tesi sono riportati la sintesi e la caratterizzazione di nanoparticelle polimeriche (NPs) ingegnerizzate potenzialmente in grado di raggiungere le cellule tumorali di glioblastoma e rilasciare selettivamente un agente chemioterapico, al fine di trattare efficacemente il GBM. Nanoparticelle costituite da PLGA-PEG e caricate con doxorubicina, un farmaco chemioterapico standard, economico e facilmente rintracciabile, sono state funzionalizzate con un peptide per garantire un target attivo. In particolare, il peptide ALMWP è stato coniugato perché può essere attivato solo dove le metalloproteinasi della matrice (MMP) sono sovraespresse, come nei microambienti di glioblastoma. PLGA-PEG è stato scelto come materiale polimerico di partenza per la produzione di nanoparticelle grazie alla sua eccellente biocompatibilità e biodegradabilità. PLGA-PEG è stato sintetizzato mediante una reazione mediata dalla carbodiimmide e il copolimero risultante è stato ulteriormente funzionalizzato con un residuo di maleimmide, per ottenere un polimero PLGA-PEG-MALE. Nanoparticelle con dimensioni > 100 nm, peghilate e che quindi evitano l’attacco da parte del sistema immunitario, sono stati ottenuti con un metodo standard di nanoprecipitazione. Al fine di rendere funzionali i nanovettori con il peptide attivabile ALMWP, le nanoparticelle PLGA-PEG-MALE sono state funzionalizzate con un ALMWP recante una cisteina terminale attraverso un'addizione di tipo Micheal a pH fisiologico, risultando in nanovettori PLGA-PEG-MALE-ALMWP. La doxorubicina (DOXO) è stata infine incapsulata con un processo di nanoprecipitazione. Tenendo conto quindi degli effetti causati da basse dosi di RT sulla BEE, ALMWP-NPs di dimensioni superiori a 100 nm dovrebbero mostrare un'elevata selettività per le cellule periferiche di GBM. Test biologici prelimiari in vitro sono stati effettuati per valutare la citotossicità e l’assorbimento delle nanoparticelle nelle cellule di glioblastoma. I test biologici sono stati effettuati dal dottorando Marco Pizzocri presso l'Istituto di Ricerca Humanitas, sotto la supervisione della Dott.ssa Lorena Passoni, nel gruppo di ricerca diretto dalla Prof.ssa Michela Matteoli. I test hanno confermato che le MMP sovraespresse nel micro ambiente tumorale aumentano l’internalizzazione delle nanoparticelle e la conseguente citotossicità dovuta alla DOXO incapsulata. Questi risultati, se confermati da ulteriori studi in vivo, potrebbe portare allo sviluppo di nuove ed effettive nanoparticelle per la cura del GBM.