Development of microfluidic structures based on polymeric scaffolds for DNA auto-aliquoting in POC real-time PCR

STMicroelectronics S.r.l. is developing a new lab-on-a-chip (LOC) which consists in a point-of-care sample-to-answer system based on real-time PCR, with diagnostic applications. The goal is to perform quantitative analysis of nucleic acids, starting from a raw sample and to generate the final response automatically in a single system, called Extraction and Amplification SYstem (EASY). This thesis is focused on the real-time PCR chip for EASY: the aim is to design, develop, prototype and test a microfluidic chip which allows an appropriate distribution of the purified sample (eluate), i.e. DNA/RNA, inside its several reaction chambers, in which real-time PCR will take place. Each reaction chamber contains a polymeric freeze-dried scaffold, which is a freeze-dried natural-origin hydrogel; these scaffolds are produces to obtain a material which is hydrophilic, stable, can be stored at room temperature and can be rehydrated with a known fixed volume of eluate, which remains entrapped inside it, in a passive way (auto-aliquoting). Thanks to morphological characterization (macroscopic, microscopic using SEM), water uptake experiments, thermal analysis (using DSC, TGA) and compatibility assay with a real-time PCR process, the best polymeric scaffolds are those made of cross-linked gelatin, in fact they display a hydrophilic structure, able to maintain a three-dimensional shape because of the chemical cross-linking, stable in the real-time PCR range temperature (60°C-100°C) and compatible with a real-time PCR process. As far as the microfluidic system is concerned, configuration 5c, which is a branched configuration with venting channels on the upper part, is the best configuration.

STMicroelectronics S.r.l. sta sviluppando un nuovo lab-on-a-chip (LOC) che consiste in un sistema sample-to-answer point-of-care basato su real-time PCR, con applicazioni diagnostiche. L'obiettivo è eseguire una analisi quantitativa degli acidi nucleici, partendo da un campione grezzo, e generare automaticamente la risposta finale in un singolo sistema, chiamato Extraction and Amplification SYstem (EASY). Questa tesi si concentra sul chip per real-time PCR di EASY: lo scopo è progettare, sviluppare, prototipare e testare un chip microfluidico che consenta un'appropriata distribuzione del campione purificato (eluato), ovvero DNA / RNA, all'interno delle sue diverse camerette di reazione, in cui si svolgerà la real-time PCR. Ogni camera di reazione contiene uno scaffold polimerico, che è un idrogelo di origine naturale liofilizzato. I requisiti che questi scaffold devono soddisfare sono: idrofilicità, capacità di mantenere una struttura tridimensionale nell’intervallo di temperatura di real-time PCR (60 ° C-100 ° C), compatibilità con un processo di real-time PCR, reidratazione con un noto volume fisso di eluato, che rimanga intrappolato al suo interno (auto-aliquoting). Grazie alla caratterizzazione morfologica (macroscopica, microscopica mediante SEM), agli esperimenti di assorbimento di acqua, all'analisi termica (eseguita utilizzando DSC, TGA) e all’analisi di compatibilità con un processo di real-time PCR, i migliori scaffold polimerici sono quelli realizzati con gelatina reticolata chimicamente. Per quanto riguarda il chip microfluidico, la configurazione 5c, che è una configurazione ramificata con canali di sfiato sulla parte superiore, è la configurazione migliore.