On the interplay between the trans and cis interactions in classical cadherins : a mutagenesis and crystallographic study

Cadherins are calcium-dependent transmembrane glycoproteins whose main function is to mediate adherens junction formation via their homotypic dimerization. Classical cadherins play a pivotal role in the maintenance of tissue integrity and, through their downstream signaling, they influence the activity of many key signaling pathways that affect survival, motility, growth, cell differentiation and tissue organization. Because of their importance in the regulation of the inside-out signaling they represent a signaling hub in the biological network and their dysregulation is often observed in pathological conditions, such as cancer. Over the years, our growing knowledge on the function and the molecular mechanism of cadherins has supported the notion that they can be viewed also as potential pharmaceutical targets. However, targeting cadherins is a complicated task since they are extremely flexible and therefore their dimerization process, which is not yet fully understood, is characterized by many different conformational states. This thesis work concentrates on the analysis of the interplay between the trans interaction, i.e. the domain swapping mechanism that allows the dimerization of cadherins protruding from two adhering cells, and the cis interaction, that allows lateral clustering of cadherins protruding from the same cell within the adherens junction. An extreme cooperativity between these two interactions has been always assumed in the literature but never experimentally demonstrated. The system we used to study this relationship is human P-cadherin. In fact, by mutating key residues in their natural sequence, this member of the classical cadherin family can likely be tuned to adopt all the different conformational states that characterize their dimerization trajectory. The techniques and theory described in this work comprise all the molecular biology needed for the engineering of protein mutants, their recombinant production, isolation, purification and crystallization. Finally, some preliminary results on the first attempts to obtain the crystal structures of E-cadherin in complex with peptidomimetic drugs are also shown and discussed.

Le caderine classiche, i cui membri prototipici sono la E- e P-caderina, sono proteine trasmembrana calcio dipendenti la cui funzione è quella di mediare l’adesione cellulare formando la giunzione aderente attraverso la loro dimerizzazione omotipica. Esse esercitano un ruolo centrale nel mantenimento dell’integrità tissutale e, attraverso i loro segnali intracellulari, influiscono sull’attività di molti signaling pathways che influenzano la sopravvivenza, motilità, crescita, differenziazione e organizzazione di molti tessuti biologici. Per la loro importanza nella regolazione dei segnali cellulari, rappresentano un nodo centrale nelle reti biologiche e la loro deregolazione è osservata in patologie come il cancro. In questi anni, la crescente conoscenza molecolare sulla loro funzione ha messo in evidenza come possano anche essere considerati importanti target farmaceutici. Tuttavia, il targeting delle caderine è complicato poiché esse sono estremamente flessibili e sono caratterizzate da molti stati conformazionali; inoltre, il loro processo di dimerizzazione non è ancora pienamente compreso. Questo lavoro di tesi si concentra sull’analisi della relazione tra l’interazione trans, cioè il meccanismo di domain swapping che permette la dimerizzazione di caderine che protrudono da cellule adese, e l’interazione cis, che permette il clustering laterale nella giunzione aderente tra caderine che protrudono dalla stessa cellula. Totale cooperatività tra queste due interazioni è sempre stata presunta in letteratura ma mai dimostrata sperimentalmente. Il sistema utilizzato per questo studio è la P-caderina, poiché, se opportunamente mutata, essa può essere forzata ad assumere tutti gli stadi conformazionali che ne caratterizzano la traiettoria di dimerizzazione. Le tecniche e la teoria descritte in questo lavoro comprendono tutti gli aspetti legati all’ingegnerizzazione dei mutanti, alla loro produzione ricombinante, isolamento, purificazione, cristallizzazione e caratterizzazione strutturale. In conclusione, alcuni risultati preliminari per l’ottenimento di strutture cristallografiche della E-caderina in complesso con molecole peptidomimetiche sono mostrati e discussi.