Impact of substrate stiffness on microglial cells : changes in abeta uptake and in cell membrane biophysical properties in Alzheimer's disease

Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative pathology, that is estimated to affect 13.2 million American by 2050 if no preventive therapies could be found. Recently, some evidence has shown that alterations in the mechanical properties of the brain tissue are implicated in the pathology. The mechanical properties of AD brain have been measured by magnetic resonance elastography (MRE) and some studies have shown that the stiffness of the human brain tissue decreases in AD subjects. As it is well known, the microenvironment surrounding the cells has several effects on the cell functions. One of the main objective of this research is to investigate and evaluate how the mechanical properties of the cellular environment affect the AD-related microglial cell functions, in particular the oligomeric amyloid-β (Aβ) peptides uptake. Furthermore, recent studies have shown an increase in the expression level of cytosolic phospholipse A2 (cPLA2), a lipolytic enzyme responsible for hydrolysing the acyl group from the sn-2 position of membrane glycerophospholipids with a preference for arachidonic acid acyl chain, in BV-2 microglial cells cultured on softer substrates. This protein is activated by Aβ peptide in AD brains and its phosphorylation is correlated with an augmented uptake of these peptides by microglial cells. The aim of the project is to evaluate how the changes, induced by cPLA2, in the phospholipid composition of cellular membranes could affect structural, mechanical and dynamic properties of the bilayer. These properties are linked with macroscopic differences, such as altered molecular order and fluidity, which in turn could be linked with different endocytic rate. Combining experimental and computational approaches we want to highlight the differences in the microglial Aβ uptake on different elastic substrates and link this alterations with changes in the membrane properties induced by different expression and activation levels of cPLA2 protein, in order to understand how the enzymatic and endocytic functions of microglial cells could be altered according to the environment that surrounds them. The experimental results demonstrate that the stiffness of the matrix influences the proliferation capabilities of the microglial cells, and also it has effects on the amyloid internalization: a higher amyloid-β uptake is observed on softer substrate compared to harder surface. The simulation results highlight a difference in the molecular order in physiological and cPLA2-induced pathological membrane models, which, with further analysis, could be linked with different endocytic rates. These researches will provide new knowledge regarding the Aβ uptake in Aβ-stimulated microglial cells under the effects of different substrate stiffness and dinstinct activation rates of cPLA2, in order to find possible therapeutic agents able to limit the formation of amyloid plaques.

L'Alzheimer (AD) è una patologia neurodegenerativa, il cui impatto sulla società è stimato a raggiungere 13.2 milioni di Americani nel 2050; per questo il suo studio è imperativo al fine di trovare agenti terapeutici e terapie preventive. Recentemente alcuni studi hanno dimostrato che, nel corso della patologia, si hanno delle alterazioni delle proprietà meccaniche del tessuto cerebrale. Queste proprietà meccaniche sono state misurate grazie a tecniche di risonanza magnetica elastografica (MRE), riscontrando una minore rigidezza in cervelli di pazienti malati. Certamente la matrice che circonda le cellule ha molti effetti sulle funzioni cellulari ed enzimatiche. Per questo motivo, uno dei principali obiettivi di questa ricerca è investigare e valutare l'influenza delle proprietà meccaniche dell'ambiente cellulare sulle funzioni di cellule microgliali in relazione alla patologia di Alzheimer, in particolare focalizzandosi sull'assorbimento di peptidi amiloidi-β (Aβ) oligomerici. In aggiunta, recenti studi hanno anche dimostrato un aumento nel livello di expressione della proteina fosfolipase citosolica A2 (cPLA2) in cellule microgliali BV-2 coltivate su substrati a minore rigidezza. cPLA2 è un enzima resposanbile dell'idrolisi del gruppo acile nella posizione sn-2 di glicerofosfolipidi di membrana, con una preferenza per acidi grassi contenenti acido arachidonico. Questo enzima è fosforilato dagli Aβ peptidi, caratteristici della patologia, e la sua attivazione è correlata ad un aumento nell'assorbimento di questi peptidi da parte di cellule microgliali. Un secondo scopo del seguente progetto di tesi è quello di valutare come le alterazioni indotte da cPLA2 sulla composizione fosfolipidica di membrane cellulari, possa influenzare le proprietà strutturali, meccaniche e dinamiche del doppio strato fosfolipidico. Queste caratteristiche sono collegate con alterazioni macroscopiche, riguardanti l'ordine molecolare e la fluidità di membrana, le quali possono essere ulteriormente associate a meccanismi di endocitosi. Il seguente progetto di tesi ha lo scopo di evidenziare, tramite approcci sperimentali e computazionali, le differenze nell'assorbimento di Aβ peptidi da parte di cellule microgliali coltivate su differenti substrati elastici, e collegare queste alterazioni con cambiamenti nelle proprietà biofisiche della membrana cellulare, indotte da livelli di expressione di cPLA2 alterati, al fine di comprendere come le funzioni enzimatiche e endocitiche delle cellule microgliali siano influenzate dall'ambiente che le circonda. I risulati sperimentali hanno dimostrato che la rigidezza della matrice ha influenza sulle capacità proliferative delle cellule microgliali e anche effetti sull'internalizzazione di Aβ peptidi: un assorbimento maggiore è stato osservato su substrati a minore rigidezza. I risultati delle simulazioni hanno evidenziato una differenza nell'ordine molecolare in modelli di membrana fisiologici e patologici, questi ultimi indotti da una sovra-espressione di cPLA2. Questa ricerca può fornire un ulteriore conoscenza sull'assorbimento di Aβ peptidi in cellule microgliali sotto l'effetto di superfici a differente rigidezza e con differenti livelli di espressione e attivazione della proteina cPLA2, allo scopo di individuare un possibile agente teraputico in grado di limitare la formazione di placche amiloidi.