Dual-color on-chip imaging of drosophila embryos by selective-plane-illumination-microscopy

In the last years several microscopy techniques for biological inspection have been developed. Fluorescence Microscopy is an imaging method extremely powerful, object of an increasing interest among the scientific community for the important advantages that entails. Light-Sheet-Microscopy (LSM) and in particular Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) are natural evolution of that. In the SPIM, a fluorescence-marked sample is illuminated with a light sheet created by a cylindrical lens, obtaining a plane-by-plane optical sectioning, with the main advantage of a three-dimensional sample reconstruction at high speed and low photodamage rate. A Lab-on-a-chip approach of this technique has been undertaken with the purpose of limiting the time dedicated to the sample mounting and to simplify the alignment procedures. The combination of these two factors significantly decreased the imaging time making the SPIM suitable for high throughput analysis. A combination of optical and fluidic elements have been integrated on the same substrate by means of the FLICE (Femtosecond Laser Irradiation followed by Chemical Etching) technique to obtain a device able to perform a double-wavelength excitation. This thesis work is focused on the fabrication and characterization of a prototype of SPIM On Chip able to perform double-wavelength investigation with a cylindrical microlens fabricated in the substrate. A microfluidic network will facilitate the passage of a suspended solution of biological samples through the light sheet, thus performing automatically SPIM imaging on a compact platform. Moreover, the project is focused on a particular biological specimens, Drosophila Melanogaster embryos, a very interesting and widely used animal model that, because of its ellipsoidal shape, required an optimization of our fluidic network in order to facilitate the sample delivery and translation through the light sheet.

Negli ultimi anni si è assistito ad un crescente interesse verso la microscopia a fluorescenza. I motivi sono molteplici, basati principalmente sulla specificità di questo approccio che consente di acquisire immagini di un campione fluorescente con un ottimo rapporto segnale rumore. La microscopia a fluorescenza trova ampio impiego in vari ambiti, fra cui spicca quello biomedicale. Come conseguenza si è assistito ad un crescente sviluppo di svariate tecniche, ciascuna delle quali caratterizzata da vantaggi e svantaggi. Fra queste risalta la microscopia a foglio di luce. Essa permette di ottenere immagini tridimensionali del campione in analisi tramite un rapido e non invasivo sezionamento ottico che si basa sull’utilizzo di un fascio focalizzato in un’unica dimensione per ottenere un piano di luce. Allo stato attuale questo metodo presenta però alcune caratteristiche che ne limitano l’impiego. Infatti, è necessario possedere microscopi dedicati e molto costosi, oppure, in alternativa, se si è esperti di ottica e microscopia, è possibile realizzare il proprio microscopio a foglio di luce. Questa opzione non è sicuramente usufruibile da un gran numero di potenziali utenti e spesso va a discapito della compattezza dello strumento realizzato. Inoltre, ad oggi, questa tecnica, nonostante permetta di acquisire immagini tridimensionali di un singolo campione molto rapidamente, non è adatta allo studio di un numero di campioni statisticamente rilevante. Ciascuno di questi deve essere posizionato e allineato manualmente sul microscopio, limitando la velocità dell’analisi. A valle di queste problematiche, nel nostro gruppo di ricerca, abbiamo lavorato sulla realizzazione di un dispositivo optofluidico portatile che permettesse di acquisire automaticamente le immagini di tutti i campioni contenuti in una soluzione liquida tramite microscopia a foglio di luce. Questo dispositivo, fabbricato in un substrato vetroso di pochi millimetri cubi, integra gli elementi ottici necessari per la realizzazione del foglio di luce e quelli fluidici per lo scorrimento del campione in analisi. In particolare, in questo lavoro di tesi, ci siamo concentrati sulla realizzazione di un prototipo capace di ottenere immagini a due colori di embrioni di drosofila. A questo scopo sono stati sviluppati e ottimizzati sia un sistema di illuminazione integrato per la realizzazione del doppio foglio di luce, sia un sistema fluidico utilizzato per inserire efficacemente i campioni nel dispositivo e per farli fluire evitando eventuali rotazioni o traslazioni. Aspetto non banale, dato il profilo ellittico del campione.