Optimising polymer carrier properties for a CaP bone graft in posterolateral spinal fusion

Abstract Introduction After failure of the conservative treatments, spine fusion is commonly indicated to treat spinal disorders that can cause discomfort and back or leg pain. There exist different surgical approaches for spine fusion, of which posterolateral spine fusion (PLF) is one of the most followed. Nowadays autograft harvested from iliac crest is the golden standard graft used to fuse two vertebrae, however it has limitations that prompted surgeons to ask for efficient substitutes. To date, the synthetic bone grafting substitute market consists mainly of calcium phosphate (CaP) ceramic materials, which are most available in the granule format. Surgeons often use these granules either as autograft extenders (i.e. blended with small volumes of autograft particulate) or as standalone. Kuros Biosciences BV developed and offers to clinicians MagnetOs Granules (CE marked and FDA cleared) with granule size of 1-2 mm, and is a biphasic calcium phosphate (BCP) ceramic with an engineered needle-like sub-micron surface structure (Figure 1a). The particular features of the surface of MagnetOs Granules gives the graft excellent biological properties, that lead to accelerated bone formation compared to competitor similar products. Figure 1. (a) SEM image of the specific surface topography of MagnetOs Granules. (b) Sample of MagnetOs Putty However, often ceramic granules are difficult to handle during the surgical procedures and can migrate from the site post-surgery leading to underperformance of the fusion procedure. Therefore, Kuros Biosciences BV developed an extension of the MagnetOs Granules product, the MagnetOs Putty® (Figure 1b) that comprises of a moldable binder (LEOL) that provides cohesion to the MagnetOs Granules and allows surgeons to shape and fit them to the defect without loss or dispersion of the granules. The LEOL is a poly(L-lactide)-poly(ethylene glycol)-poly(L-lactide) triblock copolymer (PLA-PEG-PLA) based material, synthesized via a traditional ring-opening polymerization (ROP) of L-lactide monomer in presence of a blend of PEG 1000 Da and PEG 2000 Da as initiators. The presence of two types of PEG molecules with different molecular weights leads to the simultaneous formation of two PLA-PEG-PLA copolymers that blends together resulting in the LEOL binder. Kuros Biosciences BV specifically designed this polymer blend as binder for MagnetOs Granules based on a panel of very strict requirements to preserve the biological potential of the MagnetOs Granules contained in the Putty, which include: (1) The polymer must be anhydrous to prevent hydrolysis of the contained ceramic that might change their specific surface topography [12]; (2) The polymer must start to dissolve in the surrounding aqueous environment not earlier than 2 hours, to ensure that the surgeon has sufficient time to implant the Putty without dispersion of the MagnetOs Granules; (3) The polymer must be completely dissolved within 48 hours, to ensure that the specific surface of MagnetOs Granules is exposed to the surrounding biological microenvironment and does not delay the trigger of the cascade of biological events leading to bone formation [12, 13]; (4) Immediately after dissolution, the polymer must start hydrolyze into small residuals that should be not have a molecular weight larger than 50 kDa to not hinder their clearance from the body [14]. Next to the specific requirements set by Kuros Biosciences BV, the polymer should comply also with more traditional characteristics such as biocompatibility and non-cytotoxicity, non-pyrogenic, non-irritant non-mutagenic and non-cancerogenic, sterilizable via traditional methods such as gamma-irradiation and be manufactured with an easy and controllable route that can be performed under good manufacturing practice (GMP) conditions in cleanrooms. The developed, and proprietary, LEOL binder formulation led to the manufacturing of MagnetOs Putty with excellent handling properties and could perform as good as MagnetOs Granules and autograft in achieving spinal fusion in rabbit and sheep PLF models. MagnetOs Putty has obtained CE mark and is FDA cleared, and therefore is accessible to EU and US clinicians. Now Kuros Biosciences BV wishes to further extend the MagnetOs product line, with an injectable version to implant MagnetOs Granules for spine fusion with minimally invasive procedures. The company wants to keep the size of MagnetOs Granules at 1-2 mm because granules with this dimension are the best performant for spinal fusion. Scientists at Kuros Biosciences BV discovered that, unfortunately, LEOL binder combined with MagnetOs Granules 1-2 mm does not provide an injectable Putty because of the excessive waxy character of the polymer. Therefore, there is the need to redesign LEOL or develop a new binder’s formulation for an Injectable MagnetOs Putty. The primary objective of this work of thesis is to select one or more binder formulations to be combined with MagnetOs Granules into an Injectable Putty. The work described in this thesis was conducted under the design constraints for the polymer listed earlier for LEOL binder. Two different strategies were followed: complete and partial re-design of the LEOL formulation to render it more suitable for an injectable material. The complete redesign of LEOL polymer consisted in three major changes, that led to two families of polymers, linear triblock and branched block polymer: (1) Replacement of the PLA block with poly(-caprolactone) (PCL) block, under the hypothesis that PCL, being it less fragile and stiff than PLA, would reduce the original waxy fragile properties of LEOL; (2) Use of one PEG type only, with molecular weight 2000 Da; (3) Use of glycerol to branch the polymer structure, with the hypothesis that this would render it more flexible. The second strategy simply consisted in varying the PEG blend in LEOL: (1) Replacement of PEG 1000 Da with PEG 400 Da, under the hypothesis that PEG 400 Da would render the LEOL’s original rheological properties more fluid. Polymer Design: Strategy 1 Linear triblock copolymers (PP) were successfully synthesized via traditional ROP of -caprolactone monomer in presence of PEG 2000 Da and propanol as initiator. Four polymers with different PEG-to-PCL molar ratio were prepared (Table 1). Branched block copolymers (GPP) were synthesized via two-step synthesis, with the first step consisting in the polycondensation of glycerol with PEG, and as second step a traditional ROP -caprolactone monomer in presence of glycerol-PEG multi-blocks and propanol as initiator. Four polymers were prepared, with increasing PCL block lengths (Table 1). The structure of the resulting polymers is sketched in Figure 2. Table 1. Polymers synthesized for the two families. Glycerol-to-PEG ratio was kept fixed as 1:3. PEG-to-PCL ratio PCL-PEG-PCL GLY-PEG-PCL 1:10 √ √ 1:30 √ √ 1:60 √ √ 1:90 √ √ Figure 2. (a) linear triblock copolymers PCL-PEG-PCL. (b) branched block copolymers GLY-PEG-PCL. NMR and FTIR analyses highlighted successful synthesis of all PP and GPP polymers, with a good control of the synthesis process with the formation of ester bonds between PCL and PEG blocks. PCL block length was well controlled in all the copolymers and led to progressive increase of the number average molecular weight (Mn) and of the number of caprolactone units in PCL blocks (both calculated via quantitative NMR) as well as of the melting temperature as determined with DSC measurements (Table 2). Confirmation of the occurred polycondensation of glycerol with PEG into multi-blocks was seen by complete solid waxy state of the resulting multi-block and is corroborated by the number of CL units indicating that the use of glycerol effectively generated a tri-branched copolymer since the total number of CL units in the polymer is approximately three times than the number of CL units in the linear copolymer (Table 2). This led also to a significant increase of the Mn of the branched polymers respect to the linear ones. Table 2. Physicochemical properties of the PP and GPP copolymers. CL stand for caprolactone units, Mn is the number average molecular weight calculated from NMR data and Tm is the melting temperature as measured with DSC. Polymer CL units in PCL block Mn [Da] Tm [C] PP 1:10 13.8 5130 41.4 PP 1:30 39.4 10953 47.3 PP 1:60 76.2 19345 51.3 PP 1:90 116.6 28553 53.8 GPP 1:10 8.7 9002 40.1 GPP 1:30 27.5 15437 42.9 GPP 1:60 52.1 23864 50.8 GPP 1:90 77.2 32425 52.1 The longer the PCL block in the copolymer was, the slower the dissolution of the polymers was. The dissolution of all materials, except those with 1:90 ratio, was shorter than 24 hours. In the meantime, the dissolution process of all the copolymer studied was complete between one and two hours. The mechanical testing highlighted that the copolymers PP and GPP with 1:60 and 1:90 were extremely stiff and fragile, while those with shorted PCL blocks were moldable in the room temperature range (20-40C), with a major elastic contribution to the mechanical behavior at temperatures lower than their melting point, and thereafter assuming a more viscous behavior. The effect of the presence or absence of glycerol on the dissolution and rheological characteristics was negligible due to its small amount in the polymer. Polymer Design: Strategy 2 Linear triblock copolymers PLA-PEG-PLA were successfully synthesized via traditional ROP of 15%wt. L-lactide monomer in presence of different blends of PEG 400 Da and PEG 2000 Da as initiator (85%wt) (Table 3). Since PEG molecules do not react between each other, the resulting binders were blends of PLA-PEG-PLA copolymers having PEG 400 Da and PEG 2000 Da, in the same proportions as the feeding PEG (Figure 3). Figure 3. Linear copolymer PLA-PEG-PLA. The final result of the contemporaneous reaction is a blend of copolymers LEOL. Red are LEOL molecules originated from PEG 1000 Da and blue are LEOL molecules originated from PEG 400 Da. NMR and FTIR analyses highlighted successful synthesis of all the three polymers, with a good control of the synthesis process with the formation of ester bonds between PLA and PEG blocks. The Mn, as well as the number of lactic acid units in PLA blocks, as calculated from NMR, decreased with the increase of the PEG 400 Da content in the initial PEG blend. Further, the melting point decreased as well with the increase of the PEG 400 Da proportion (Table 4). Table 3. Polymers synthesized for the PLA-PEG-PLA family. Polymer PEG blend composition [%wt.] IN01 30% PEG 400 Da / 70% PEG 2000 Da IN02 25% PEG 400 Da / 75% PEG 2000 Da IN03 20% PEG 400 Da / 60% PEG 2000 Da Table 4. Physicochemical properties of the PLA-PEG-PLA family. LA stand for lactic acid units, Mn is the number average molecular weight calculated from NMR data and Tm is the melting temperature as measured with DSC. Polymer LA units in PLA block Mn [Da] Tm [C] IN01 2.37 1875 38 IN02 2.50 1962 42 IN03 2.56 2049 41 Since the differences in PEG 400 content in the three copolymers were small, the dissolution behavior was similar: they all dissolved within 40 and 60 minutes. Rheological analysis highlighted that these copolymers had a major viscous contribution to the mechanical behavior than the elastic contribution in the room temperature range (20-40C). Injectable Putties By using a gravimetric principle, Injectable Putties were manufactured by blending MagnetOs Granules (1-2 mm) with all the polymers described earlier (Figure 4). The injectability and handling characteristics of the Injectable Putties was blindly tested by three evaluators on a plastic model of a spinal segment Figure 5), and a score was assigned to each Putty (Table 5) based on a predefined evaluation scale of properties. The Injectable Putty from each family of polymer that obtained the highest grade was selected for further testing. Figure 4. The gravimetric method used to prepare the Injectable MagnetOs Putties. Table 5. Injectability performance scoring for each Injectable Putty, and description. The Putties highlighted with bold and italic character were selected for further testing. Injectable Putty Score Observation PP 1:10 25 Good inject ability preadable in the defect PP 1:30 19.5 Pushable, hard Not easy to insert in defect PP 1:60 18 Not pushable, hard and brittle PP 1:90 18 Not pushable, hard and brittle GPP 1:10 24 Good inject ability Spreadable in the defect GPP 1:30 19 Pushable, hard Not easy to insert in defect GPP 1:60 17 Not pushable, hard and brittle GPP 1:90 18 Not pushable, hard and brittle IN01 23.5 Injectable, but too sticky IN02 25.5 Good injectability Spreadable in the defect IN03 25 Injectable Some stickiness The presence of MagnetOs Granules delayed the dissolution of the polymer, leading to complete disruption of the IN02 Injectable Putty within 90 minutes (instead of the 40 to 60 minutes of the IN02 polymer) while complete disruption of the selected PP 1:10 and GPP 1:10 Putties occurred within 48 hours (instead of about 3 hours of the polymers). After dissolution of the polymer, that loosened chemically and topographically unaltered MagnetOs Granules, hydrolysis occurred on all the polymers. Ester bonds between PEG and PLA blocks as well as those between lactic acid units within PLA blocks were quickly hydrolyzed within days for IN02 and led to the release of unaltered PEG molecules as well as lactic acid mono- and oligomers as demonstrated by NMR monitoring during time. The degradation of PP and GPP polymer was slower and less obvious than IN02, and the hydrolysis at the ester bonds between PEG and PCL blocks as well as those within PCL blocks led to the release of unaltered PEG blocks as well as of PCL oligomers. However, due to the hydrophobicity given by the long PCL blocks it is expected that most residuals are still PEG-PCL molecules or entire PCL blocks. The presence of glycerol led to a fast, initial, decrease of Mn due to the potential detachment of PEG-PCL tails from glycerol. When culture mediums were conditioned with the three selected polymers and Injectable Putties, they affected the cell proliferation and metabolic activity (as indicated by ALP production) as well as the calcium deposits formation. Due to fast hydrolysis of IN02, many acidic products from PLA blocks were released from the polymer and the Putty, which had a more negative impact on cells than the PP and GPP-based materials (Figure 5). On the other side, PP and GPP polymers had little degradation products and, consequently, their influence on cells was lower. Despite no cytotoxicity was caused by PP and GPP, no explanation could be given for the outperformance of cells in presence of PP and GPP compared to the unconditioned basal medium (Figure 5). Calcium deposits, as stained with alizarin red, were consistent with the ALP production. The expected positive effect of MagnetOs Granules on the cells could not be seen observed because the Granules need longer conditioning times to release calcium and phosphate ions into the medium. Figure 5. (a) Proliferation expressed as DNA. (b) Metabolic activity expressed as ALP production. All the measurements for the samples were normaliyed on the negative control (i.e. unconditioned medium). Discussion and Conclusions This work of thesis paved the way for the development of alternative binder formulations than LEOL for a future Injectable MagnetOs Putty. Three formulations, i.e. PP 1:10, GPP 1:10 and IN02, were selected as potential candidates. The polymer PP 1:10 showed to be a more promising candidate for the development of the Injectable MagnetOs Putty. In fact, the addition of glycerol to PP did not show any substantial improvement. Furthermore, compared to GPP 1:10, the binder PP 1:10 can be manufactured with a simpler and more controllable synthesis process. In favor of the selection of PP 1:10 polymer respect to IN02 is its longer dissolution time, which might give more time to the surgeon to operate facilitating the correct placement of the Putty during surgery. Although the degradation of PP 1:10 is slower, it can be eliminated from the human body because its starting molecular weight is lower than 50 kDa [14]. However, further work is suggested to optimize these binders and test their performances more from an industrial perspective. For example, studies on the effects that a standard sterilization technique like gamma-irradiation can have on the polymer, with potential worsening of the Putty performance, or a shelf-life study of the Putty to evaluate if the polymer affects MagnetOs Granules during storage and transportation. Furthermore, animal studies in spine fusion models should be performed to evaluate the performance of the Putty compared to autograft as well as to evaluate potential accumulation of degradation products in target organs.

Sommario Introduzione La fusione spinale è una procedura chirurgica molto diffusa volta al trattamento di differenti patologie che portano ad avere un peggiore tenore di vita. Questa procedura ha l’obiettivo di stabilizzare l’unità vertebrale immobilizzandola. Esistono diversi approcci chirurgici per la fusione delle vertebre della colonna vertebrale, tra cui la fusione spinale postero-laterale (postero-lateral fusion, PLF) è quella più eseguita. L’approccio PLF porta ad unire due o più vertebre mediante l’impianto di graft di osso autologo che induce la formazione di neo-tessuto con conseguente fusione delle vertebre; talvolta, insieme al graft, vengono impiantate viti, placche e gabbie per promuovere la fusione. Generalmente, come graft, si utilizza la cresta iliaca prelevata dal paziente stesso che rappresenta il golden standard per questa procedura, in quanto consente di ottenere migliori risultati in termini di integrazione e osteoinduzione [1]. L’utilizzo della cresta iliaca, però, comporta una operazione chirurgica aggiuntiva, dolore al paziente e, inoltre, ve ne è limitata disponibilità. A causa di questi svantaggi si sono in fase di studio possibile alternative che stimolino la formazione di nuovo tessuto osseo; tra queste vi è lo sviluppo di graft ossei sintetici. A tal scopo si sono studiati fattori di crescita ossea, quale la proteina morfogenica ossea (rhBMP-2), commercialmente disponibile, che possiede un forte potenziale osteoinduttivo, ma è difficile da mantenere in sito con conseguente crescita ossea ectopica indesiderata [2]. Ad oggi, i graft ossei sintetici, costituiti principalmente da materiali ceramici a base di fosfato di calcio (CaPs), rappresentano una valida alternativa al golden standard, in particolare una classe di materiali ceramici a base di idrossiapatite, HA, e β-tricalcio fosfati, β-TCP. Questi hanno catturato l’attenzione già dai primi anni ’90 perché possiedono una composizione simile a quella dell’osso e hanno rivelato buone capacità osteoinduttive. Molti studi hanno dimostrato, infatti, che materiali ceramici a base di CaPs, aventi anche superfici microstrutturate, possiedono l’abilità unica di indurre la crescita di osso anche quando impiantati in siti dove le cellule della linea osteogenica sono normalmente assenti (per esempio impiantati nel tessuto muscolare) [3-11]. Già dagli anni ’80, sono stati lanciati sul mercato un gran numero di sostituti ossei sotto forma di blocchi e granuli di calcio fosfati. I chirurghi usano più di frequente la forma granulare come autograft extenders (cioè miscelati con piccoli volumi di osso autologo) o come stand-alone. Per quanto riguarda i granuli, data la difficoltà nel maneggiarli in sede chirurgica e nel mantenerli in sito, attualmente, questi si sono evoluti e vengono venduti in forma di paste e putties. In particolare, le putties nascono dall’incorporazione dei granuli ceramici in una matrice malleabile che permetta di modellare il materiale composito risultante a seconda della forma del difetto da colmare. Il chirurgo andrà quindi, con maggiore facilità, a posizionare la putty nella sede desiderata. Una volta impiantata la putty, la matrice, a contatto con i fluidi corporei, si dissolverà in tempi opportuni permettendo il mantenimento dei granuli di CaPs nel sito desiderato e la loro colonizzazione da parte delle cellule. Un’ulteriore evoluzione delle putty è rappresentata da paste iniettabili tramite siringa che permettono un approccio meno invasivo con il paziente. Kuros Biosciences BV (Bilthoven, The Netherlands) ha sviluppato MagnetOs Putty®, prodotto utilizzato come sostituto osseo sintetico nelle procedure di fusione spinale promovendo la formazione di tessuto osseo pari all’autograft. Questo prodotto basa le sue proprietà osteoinduttive sull’utilizzo di MagnetOs Granules (marcati CE e approvati dalla FDA), granuli in calcio fosfato bifasici costituiti per il 25-35% da idrossiapatite e il restante 75-65% tricalcio fosfati. Tali granuli hanno dimensioni comprese tra 1 e 2 mm e hanno una particolare topografia superficiale; sono, infatti, rivestiti da nano-aghi che gli permettono di guidare le cellule e promuoverne la differenziazione accelerando la produzione di nuovo tessuto osseo. Figura 1. Immagini SEM: 1) granuli MagnetOs e 2) loro topografia superficiale. Date le difficoltà nel maneggiare i granuli durante la procedura chirurgica e il rischio di migrazione dal sito di impianto, Kuros Biosciences BV (Bilthoven, The Netherlands) ha appositamente progettato una matrice polimerica come legante per tali granuli: il LEOL, un copolimero costituito da un tri-blocco di poli(lattide)-poli(etilene glicole)-poli(lattide), PLA-PEG-PLA, con 15-25% di acido poli-lattico e 85-75% costituito da un blend di PEG 1000 Da e PEG 2000 Da. Il LEOL viene prodotto tramite reazione di polimerizzazione per apertura dell’anello del lattide in cui la miscela di PEG funge da iniziatore. Il design di tale copolimero si è basato su una serie di requisiti molto precisi, per preservare il potenziale biologico dei MagnetOs Granules contenuti in esso. Questi requisiti includono: 1) Il polimero deve essere anidro per prevenire l'idrolisi della componente ceramica (CaPs) contenuta che potrebbe modificare la caratteristica topografia superficiale [12]; 2) Il polimero deve iniziare a dissolversi nell’ambiente circostante non prima di 2 ore dall’impianto, per assicurare che il chirurgo abbia tempo sufficiente per impiantare la putty senza dispersione dei granuli; 3) Il polimero deve essere completamente degradato entro 48 ore, per garantire che la superficie dei granuli di MagnetOs sia esposta al microambiente biologico circostante e non ritardare il trigger della cascata di eventi biologici che portano alla formazione ossea [12, 13]; 4) il polimero deve degradarsi in macromolecole che non devono avere un peso molecolare maggiore di 50 kDa per non ostacolare la loro clearance dal corpo [14]. Oltre ai requisiti specifici stabiliti da Kuros Biosciences BV (Bilthoven, The Netherlands), il polimero deve essere conforme anche a caratteristiche più tradizionali come biocompatibilità e non citotossicità, non deve essere pirogenico, irritante, mutageno e cancerogeno. Inoltre, deve essere sterilizzabile tramite metodi tradizionali come la sterilizzazione ai raggi  e deve essere prodotto con un percorso facile e controllabile, che può essere eseguito in buone condizioni di produzione (GMP) in camera bianca. Figura 2. Esempio di MagnetOs Putty. La formulazione del LEOL ha portato alla produzione di MagnetOs Putty (Figura 2) con eccellenti proprietà di manipolazione e con un’efficienza pari a quella dei MagnetOs Granules e dell’autograft nel promuovere la fusione spinale nei modelli animale di PLF (i.e., coniglio e pecora). MagnetOs Putty ha ottenuto il marchio CE ed è approvato dalla FDA; è quindi accessibile ai medici europei e statunitensi per impiego in clinica. Kuros Biosciences BV (Bilthoven, The Netherlands) desidera estendere ulteriormente la sua linea di prodotti MagnetOs, con una versione iniettabile per l’impianto di granuli tramite procedure mini-invasive, mantenendo la dimensione dei granuli MagnetOs tra 1 e 2 mm, in quanto queste si sono dimostrate migliori per la fusione spinale. Il binder polimerico sviluppato da Kuros Biosciences BV (Bilthoven, The Netherlands), combinato con MagnetOs Granules (intervallo dimensionale: 1 - 2 mm) non è iniettabile a causa dell’eccessivo carattere ceroso del polimero. Pertanto, vi è la necessità di riprogettare LEOL o sviluppare una nuova formulazione della matrice polimerica, così da poter ottenere una MagnetOs Putty iniettabile. L’obiettivo principale di questo lavoro di tesi è quello di selezionare una o più formulazioni di binder polimerici da combinare con MagnetOs Granules in una putty iniettabile. Il lavoro descritto in questa tesi è stato condotto mantenendo i vincoli di progettazione per il polimero elencati in precedenza per il LEOL. Per rendere la putty un materiale iniettabile, sono state seguite due diverse strategie: 1) riprogettazione totale della formulazione LEOL; 2) riprogettazione parziale della formulazione LEOL. La completa riprogettazione del polimero LEOL consiste in tre importanti cambiamenti, che hanno portato a due famiglie di polimeri, un triblocco lineare e un polimero a blocchi ramificati, brevemente illusrati qui di seguito:: 1) Sostituzione del blocco PLA con un blocco di poli (caprolattone), PCL, nell’ipotesi che il PCL, essendo meno fragile e rigido del PLA, potrebbe ridurre le proprietà fragili originali di LEOL; 2) Uso di un solo tipo di PEG, con peso molecolare 2000 Da; 3) Uso del glicerolo per ramificare la struttura polimerica, con la possibilità di renderlo più flessibile. La seconda strategia consiste, semplicemente, nel variare la miscela di PEG all’interno del LEOL: 1) Sostituzione di PEG 1000 Da con PEG 400 Da, nell'ipotesi che PEG 400 Da diminuisca le proprietà reologiche originali di LEOL (i.e., minore viscosità). Materiali e Metodi Binders polimerici anidri per granuli di calcio fosfati Sintesi dei copolimeri I copolimeri triblocchi lineari costituiti da PEG e PCL (PP) sono stati sintetizzati tramite ROP tradizionale del monomero -caprolattone in presenza di PEG 2000 Da, propanolo come iniziatore e Tin (II)-etilesanoato (SnOct2) come catalizzatore. La reazione è avvenuta per 24 ore a 130 °C in atmosfera inerte, ottenuta tramite cicli alternati di vuoto e argon. Sono stati preparati quattro polimeri con un rapporto molare PEG-PCL diverso (Tabella 1). I copolimeri a blocchi ramificati, contenenti glicerolo, PEG e PCL (GPP), sono stati sintetizzati tramite una reazione di sintesi svolta in due fasi, con il primo stadio consistente nella policondensazione di glicerolo con PEG e come secondo passo una tradizionale ROP del monomero -caprolattone in presenza di multi-blocchi di glicerolo-PEG e propanolo come iniziatore. Sono stati preparati quattro polimeri, con blocchi di PCL di diverse lunghezze (Tabella 1). Tabella 1. Polimeri sintetizzati per le due famiglie. Il rapporto Glicerolo-PEG è stato fissato a 1:3. Rapporto PEG:PCL PCL-PEG-PCL GLY-PEG-PCL 1:10 √ √ 1:30 √ √ 1:60 √ √ 1:90 √ √ La struttura dei polimeri risultanti è schematizzata nella figura 3. Figure 3. (a) Copolimero a triblocco lineare PCL-PEG-PCL, (b) copolimero ramificato multiblocco GLY-PEG-PCL. I copolimeri a triblocco lineare PLA-PEG-PLA sono stati sintetizzati attraverso la tradizionale ROP del monomero L-lattide (15% in peso) in presenza di diverse miscele di PEG 400 Da e PEG 2000 Da, utilizzato come iniziatore (85% in peso), con l’ausilio di SnOct2 come catalizzatore (Tabella 2). Poiché le molecole di PEG non reagiscono tra loro, i leganti risultanti erano miscele di copolimeri PLA-PEG-PLA aventi PEG 400 Da e PEG 2000 Da, nelle stesse proporzioni presenti nel blend di PEG(Figura 4). Figura 4. Copolimero lineare PLA-PEG-PLA. Il risultato finale della reazione è un blend di copolimeri di LEOL. In rosso sono le molecole di LEOL originati da PEG 1000 Da e in blu quelle da PEG 400 Da. Tabella 2. Polimeri sintetizzati della famiglia PLA-PEG-PLA. Polimero Composizione blend di PEG [%wt.] IN01 30% PEG 400 Da / 70% PEG 2000 Da IN02 25% PEG 400 Da / 75% PEG 2000 Da IN03 20% PEG 400 Da / 60% PEG 2000 Da Caratterizzazione dei copolimeri L’efficienza della reazione di sintesi è stata valutata calcolando la dimensione effettiva dei blocchi dei copolimeri dagli spettri ottenuti tramite risonanza magnetica nucleare protonica (1H-NMR). L’analisi ATR-FTIR ha permesso di identificare i gruppi funzionali presenti nei copolimeri sintetizzati, permettendo di verificare l’avvenuta sintesi. Inoltre, si è misurato il punto di fusione mediante DSC e il comportamento viscoelastico dei copolimeri è stato caratterizzato tramite prove reologiche in rampa di temperatura nel range 22 – 60 °C, comprendente le temperature alle quali i materiali polimerici potrebbero essere sottoposti durante l’operazione chirurgica. Tali binder polimerici sono anche stati disciolti in PBS a 37°C per studiarne il comportamento e lavelocità di dissoluzione in ambiente physiological-like. Produzione e caratterizzazione di putties iniettabili CaPs/polimero Usando un principio gravimetrico, le putties iniettabili sono state prodotte miscelando MagnetOs Granules (1 - 2 mm) con tutti i polimeri descritti in precedenza (Figura 5). Le caratteristiche di iniettabilità e manipolazione delle putties iniettabili sono state testate da tre valutatori su un modello di plastica di un segmento spinale (Figura 6). Figura 5. Metodo gravimetrico utilizzato per la preparazione di MagnetOs Putties iniettabili A ciascuna di esse è stato assegnato un punteggio considerando varie caratteristiche, quali l’iniettabilità, la durezza, la capacità di recupero della forma originaria e di ritenzione dei granuli, e la oleosità, in base a una scala di valutazione predefinita di tali proprietà. La putty iniettabile di ciascuna famiglia di polimeri che ha ottenuto il punteggio più alto è stata selezionata per ulteriori test di caratterizzazione e confronto. Si è osservato il comportamento che queste putties possiedono in mezzo acquoso (PBS, 37 °C), osservandone i tempi di dissoluzione e il rilascio dei granuli dalla matrice polimerica. Successivamente, si è proceduto con uno studio di degradazione in PBS a 37 °C mantenendo i campioni in agitazione per una durata complessiva di 28 giorni, con time-point a 1, 4, 7, 14, 21 e 28 giorni. Ciò ha permesso di conoscere l’influenza del binder polimerico sui granuli, di valutare il processo di degradazione del polimero e la dimensione dei residui rilasciati adeguata per una corretta eliminazione da parte dell’organismo. Ad ogni time point considerato, i granuli sono stati separati dalla soluzione contenente il polimero disciolto e sono stati lavati, mentre tale soluzione è stata fatta evaporare con un flusso di argon così da ottenere i residui polimerici in essa contenuti. Osservazioni al SEM hanno consentito di studiare qualitativamente la morfologia superficiale dei granuli di CaP per valutare se, durante la degradazione, la microstruttura superficiale si sia conservata. Tramite XRD, si è studiato il contenuto di idrossiapatite e -tricalcio fosfati nei granuli. Tramite analisi 1HNMR e FTIR si è indagata la degradazione del polimero nel tempo. I copolimeri, le putties e i granuli di CaP sono quindi stati caratterizzati in vitro mediante uno studio di citotossicità della durata di 21 giorni con time-point a 7, 14 e 21 giorni. Cellule stromali murine da midollo osseo (mBMSCs) sono state espanse in mezzo di coltura (BM) avente la composizione riportata in Tabella 5. Table 5. Composition of basal medium (BM). Componenti Volume (v/v%) αMEM (Lonza) 82.80 % Fetal bovine serum (FBS, Gibco) 15 % Glutamax (Gibco) 1% Penicillin / Streptomycin (Gibco) 1% Basic Fibroblast growth factor (bFGF, 1000 ng/mL, Gibco) 0.1% Ascorbic acid 2-phosphate (AsAp, 2x10-1 M, Gibco) 0.1% Sono stati preparati mezzi di coltura condizionati con le tre putties selezionate (12.5 mg/mL), i rispettivi polimeri (~9.5 mg/mL) e i granuli (2.98 mg/mL) lasciando le quantità̀ opportune di materiale immerse in DMEM (high D-glucose, 4.5 g/L) per 24 ± 2 ore a 37 ± 1 °C in un bagno ad acqua in agitazione a 50 ± 5 rpm. Gli eluati ottenuti sono quindi stati sterilizzati utilizzando una membrana di acetato di cellulosa (porosità: 0.2 µm). Successivamente, la preparazione di tali eluati si è conclusa con l’aggiunta degli ulteriori componenti (Tabella 6) per ottenere il mezzo completo. Si è considerato, inoltre, il mezzo di coltura completo non condizionato, come controllo negativo. Tabella 6. Composizione finale dei medium condizionati Componenti Volume (v/v%) DMEM condizionato 90.11 % Insulina-Transferrina-Selenio ITS (+1) 1.01 % L-prolina (5mM) 7.01 % Penicillina / Streptomicina (Gibco) 1 % Piruvato di sodio (100mM, Sigma-Aldrich) 0.91 % Acido ascorbico 2-fosfato (AsAp, 2x10-1 M, Gibco) 0.1 % Dopo l’espansione, le cellule sono state seminate in 0.5 ml di medium condizionato all’interno di tubi Falcon in polipropilene (Figura 6), in modo tale da ottenere dei pellet anziché le classiche colture 2D; le cellule sono state quindi centrifugate (300 rpm(?), 21 °C, 5 min) e poste in incubatore (37 °C, 5% CO2). Ricambi dei medium si sono svolti ogni 2 - 3 giorni. Ad ogni time point la proliferazione cellulare è stata valutata tramite quantificazione del DNA con QuantiFluor® dsDNA System kit (Promega, re. E2670), mentre l’attività metabolica e la differenziazione osteogenica delle cellule sono state quantificate con l’Alkaline Phosphatase Fluorescence Substrate kit ai giorni 14 e 21. I pellet cellulari, precedentemente deidratati e inglobati in paraffina, sono stati sezionati mediante microtomo in sezioni dello spessore di 5 µm, poste su vetrino, deparafinizzate e reidratate. L’attività metabolica e la differenziazione cellulare sono state valutate mediante lo staining Alizarin Red (soluzione al 2%, posta a contatto per 10-13 minuti con le sezioni dei pellet cellulari). Tale colorazione consente la visualizzazione di depositi di calcio sotto forma di noduli rossastri. Figura 6. Pellet di cellule in coltura con 0.5 ml di medium condizionato all’interno di un tubo Falcon in PP. Risultati Binders polimerici anidri per granuli di calcio fosfati Le analisi NMR e FTIR hanno evidenziato il successo della sintesi per tutti i polimeri PP, GPP e IN, con un buon controllo del processo di sintesi, la formazione di legami esteri tra i blocchi PCL e PEG, PLA e PEG e all’interno del PCL e PLA stessi. Nelle prime due famiglie di polimeri, la lunghezza del blocchi di PCL era ben controllata in tutti i copolimeri e portava ad un progressivo aumento del peso molecolare medio numerale ? (Mn) e del numero di unità di caprolattone all’interno dei blocchi PCL (entrambi calcolati quantitativamente con H NMR). La temperatura di fusione (Tm) è stata determinata mediante analisi DSC; anche Tm aumentava all’aumentare della quantità di unità di policaprolattone nei blocchi (Tabella 8). La conferma della policondensazione avvenuta nei multi-blocchi costituiti da glicerolo e PEG è stata osservata dallo stato ceroso del multi-blocco risultante ed è corroborata dal numero di unità CL indicanti che l’uso di glicerolo ha effettivamente generato un copolimero tri-ramificato dal numero totale di CL unità nel polimero che è circa tre volte rispetto al numero di unità CL nel copolimero lineare (Tabella 7). Ciò ha comportato anche un aumento rilevante di Mn per i polimeri ramificati rispetto a quelli lineari. Tabella 7. Proprietà fisico-chimiche dei copolimeri PP e GPP. CL: unità caprolattone, Mn: peso molecolare medio numerale calcolato dai dati NMR, Tm: temperatura di fusione ricavata mediante DSC. Polimero Unità di CL nel blocco di PCL Mn Tm [Da] [°C] PP 1:10 13.8 5130 41.4 PP 1:30 39.4 10953 47.3 PP 1:60 76.2 19345 51.3 PP 1:90 116.6 28553 53.8 GPP 1:10 8.7 9002 40.1 GPP 1:30 27.5 15437 42.9 GPP 1:60 52.1 23864 50.8 GPP 1:90 77.2 32425 52.1 Per quanto riguarda la famiglia di copolimeri costituiti dal triblocco PLA-PEG-PLA, il peso molecolare, così come le unità di acido lattico nel blocco di PLA, calcolati mediante NMR, sono diminuiti all’aumentare della presenza di PEG 400 Da all’interno della miscela di PEG. Anche il punto di fusione risulta minore, maggiore è la presenza di PEG 400 Da (Tabella 8). Tabella 8. Proprietà fisico-chimiche dei copolimeri della famiglia PLA-PEG-PLA. LA sta per unità acido lattico, Mn è il peso molecolare medio numerico calcolato dai dati NMR e Tm è la temperatura di fusione misurata con DSC. Polimero Unità di LA nel blocco di PLA Mn Tm [Da] [°C] IN01 2.37 1875 38 IN02 2.50 1962 42 IN03 2.56 2049 41 Dallo studio di dissoluzione dei polimeri delle prime due famiglie è risultato che più lungo era il blocco di PCL nel copolimero, più lento è stato la degradazione del materiale in PBS. La dissoluzione di tutti i materiali, ad eccezione di quelli con rapporto 1:90, era inferiore a 24 ore; in particolare, il processo di dissoluzione dei copolimeri è stato completato entro una o due ore. Per quanto riguarda i copolimeri a triblocchi PLA-PEG-PLA, si è riscontrato un comportamento di dissoluzione simile in quanto le differenze nel contenuto di PEG 400 nei tre copolimeri erano piccole: tutti si sono disciolti entro 40 e 60 minuti. La caratterizzazione meccanica ha evidenziato che i copolimeri PP e GPP con rapporto 1:60 e 1:90, erano estremamente rigidi e fragili, mentre quelli con blocchi PCL corti erano modellabili nell’intervallo di temperatura 20 - 40 °C, con un importante contributo elastico a temperature inferiori al loro punto di fusione, e, successivamente, assumendo un comportamento più viscoso. L’effetto della presenza o dell’assenza di glicerolo sulla dissoluzione e sulle caratteristiche reologiche è risultato trascurabile a causa della piccola quantità inserita nel polimero. Per i copolimeri IN01, IN02 e IN03, l’analisi reologica ha mostrato un importante contributo viscoso rispetto al contributo elastico nell'intervallo di temperatura 20 - 40 °C). Produzione e caratterizzazione di putties CaP/polimero iniettabili Test di iniettabilità su modello Durante i test di iniettabilità sul modello, è stato riscontrato che le putties contenenti polimeri PP e GPP con rapporto molare PEG:PCL da 1:60 in su, non potevano riempire il difetto osseo nel modello (Figura 7a) in quanto erano troppo rigide e viscose e non era possibile deformarle. Qualsiasi deformazione portava a una rottura fragile della putty. GPP e PP 1:30 non erano appiccicosi o oleosi e presentavano migliori proprietà di iniettabilità, ma, anche in questo caso, erano troppo rigidi. I rimanenti polimeri GPP 1:10 e PP 1:10 erano molto malleabili: è stata riscontrata una buona iniettabilità e un buon adattamento al difetto nel modello (Figura 7b). Le putties realizzate con i polimeri PLA-PEG-PLA presentavano una buona iniettabilità (Figura 7b) e, aumentando la quantità di PEG 2000 Da nel polimero, la durezza aumentava, mentre la viscosità e l'oleosità diminuivano. Tali proprietà sono riassunte in Tabella 9. Sulla base dei punteggi di valutazione (Tabella 9), le migliori Putties sono state selezionate per ulteriori studi: PP 1:10, GPP 1:10 e IN02. Figura 7. Immagini rappresentative del test di iniettabilità su modello: a) impossibilità per alcune putties di riempire il difetto osseo; b) difetto osseo completamente riempito. Tabella 9. Punteggi delle prestazioni di iniettabilità per ciascuna putty iniettabile e osservazion. Le putties evidenziate in grassetto e corsivo sono state selezionate per ulteriori test. Putty iniettabile Punteggio Osservazioni PP 1:10 25 Buona iniettabilità e buon adattamento al difetto PP 1:30 19.5 Spingibile dalla siringa, duro, non facile da inserire nel difetto PP 1:60 18 Non iniettabile, duro e fragile PP 1:90 18 Non iniettabile, duro e fragile GPP 1:10 24 Buona iniettabilità e buon adattamento al difetto GPP 1:30 19 Spingibile dalla siringa, duro, non facile da inserire nel difetto GPP 1:60 17 Non iniettabile, duro e fragile GPP 1:90 18 Non iniettabile, duro e fragile IN01 23.5 Iniettabile ma appiccicoso IN02 25.5 Buona iniettabilità e buon adattamento al difetto IN03 25 Iniettabile, leggermente appiccicoso Test di dissoluzione e degradazione in PBS La presenza di MagnetOs Granules ha ritardato la dissoluzione del polimero, portando alla completa dispersione della putty iniettabile IN02 entro 90 minuti (anziché 40 - 60 minuti osservati per il polimero IN02), mentre la dissoluzione completa delle putties contenenti PP 1:10 e del GPP 1:10 si è verificata entro 48 ore (invece di circa 3 ore dei polimeri). Durante lo studio di degradazione, tramite un’analisi qualitativa al SEM e quantitativa mediante XRD, si è verificato che i polimeri si sono disciolti lasciando i granuli MagnetOs chimicamente e topograficamente inalterati. La dimensione e la forma degli aghi che presenti sulla superficie dei granuli si sono conservate durante tutto lo studio di degradazione e le quantità percentuali di idrossiapatite e -tricalcio fosfato si sono mantenute all’interno del range originario di 25-35%wt per HA e 75-65%wt per β-TCP. Tramite le analisi 1H NMR e FTIR si è verificata l’idrolisi di tutti i polimeri. I legami estere tra i blocchi di PEG e PLA e quelli tra le unità di acido lattico all'interno dei blocchi di PLA sono stati rapidamente idrolizzati in pochi giorni per IN02 e hanno portato al rilascio di molecole di PEG inalterate e di mono- ed oligomeri dell’acido lattico. Da questo ne è conseguita una progressiva diminuzione del rapporto tra le unità di EO e LA e del peso molecolare del polimero nel tempo. La degradazione dei polimeri PP e GPP è stata più lenta e meno evidente rispetto a IN02 e l’idrolisi dei legami estere tra i blocchi PEG e PCL e quelli all’interno dei blocchi PCL ha portato al rilascio di blocchi PEG inalterati e di oligomeri PCL. Tuttavia, a causa dell’idrofobicità imputabili ai lunghi blocchi PCL, si prevede che la maggior parte dei residui siano ancora molecole PEG-PCL o interi blocchi PCL. Il peso molecolare si è mantenuto costante nel tempo e anche il rapporto tra le unità di CL e EO non ha subito variazioni significative. La presenza di glicerolo ha portato a una rapida, iniziale, diminuzione di Mn dovuta al potenziale distacco delle code di PEG-PCL dal glicerolo. Caratterizzazione biologica in vitro Cellule stromali murine da midollo osseo sono state coltivate per 28 giorni in terreni di coltura condizionati con i tre polimeri selezionati e con le putties iniettabili (i.e., eluati): questi hanno influenzato la proliferazione cellulare (Figura 8) e l’attività metabolica (come indicato dalla produzione di ALP, Figura 9) e la formazione di depositi di calcio (Figura 10). Il contenuto di DNA per tutti i materiali è aumentato nel tempo indicando una continua proliferazione cellulare. In generale, il contenuto di DNA nei mezzi condizionati con la putty e con i rispettivi polimeri ha seguito la stessa tendenza con valori simili. I mezzi di coltura preparati a contatto con polimeri e putties PP e GPP hanno dato valori di DNA molto alti, mentre quelli risultanti dal contatto con IN02 sono sempre rimasti migliori del controllo negativo, ma hanno valori di DNA inferiori. A causa della rapida idrolisi dell’IN02, molti prodotti acidi dai blocchi PLA sono stati rilasciati dal polimero e dalla putty, risultando in un impatto più negativo sulle cellule rispetto ai materiali a base di PP e GPP (Figura 8). Dall’altro lato, i polimeri PP e GPP avevano pochi prodotti di degradazione e, di conseguenza, la loro influenza sulle cellule era inferiore. Nonostante la citotossicità non sia stata causata da PP e GPP, occorrono ulteriori analisi per ottenere informazioni sulla performance delle cellule in presenza di PP e GPP rispetto al terreno tal quale (Figura 8). Figura 8. Proliferazione cellulare nei tre time-point fino a 21 giorni di coltura, in termini di contenuto di DNA. Si sono osservate differenze statisticamente significative (indicate da *) nella proliferazione tra i diversi gruppi di materiali, ma non all’interno dei gruppi o tra il polimero e la putty corrispondente. Tali risultati sono stati normalizzati rispetto al controllo negativo (medium non condizionato). Al giorno 14, è stata osservata un’alta espressione osteogenica (rispetto al controllo negativo) per le cellule coltivate in mezzo di coltura condizionato con i polimeri PP e GPP. I granuli hanno promosso la produzione di ALP tanto quanto il controllo negativo nel primo time point, mentre, dopo 21 giorni, è stato osservato un aumento dell’attività. In generale, l’andamento della produzione di ALP è aumentato nel tempo indicando una differenziazione osteogenica nel tempo nei pellet. Figura 9. Attività metabolica dopo 14 e 21 giorni di coltura espressa in termini di produzione di ALP. Si sono osservate differenze significative nella produzione di ALP tra i diversi gruppi di materiali dopo 3 settimane, ma anche all’interno dello stesso gruppo tra il primo e il secondo time-point. Tali risultati sono stati normalizzati rispetto al controllo negativo (medium non condizionato). La differenziazione cellulare è stata esaminata anche qualitativamente tramite osservazione al microscopio ottico dei pellet di cellule colorate con Alizarin Red che evidenzia la presenza di depositi di calcio: questi appaiono come noduli di colore rosso-arancio brillante (Figura 10). Dalle osservazioni è apparso che i pellet coltivati in terreno incondizionato e nel mezzo condizionato con solo i granuli presentavano pochi noduli rossi rispetto a tutti gli altri pellet cellulari. L’effetto positivo atteso dei granuli di MagnetOs sulle cellule non è stato osservato poiché i granuli richiedono tempi di condizionamento più lunghi per rilasciare ioni di calcio e fosfato nel terreno. Figura 10. Sezione di pellet cellulare colorato con Alizarin Red; le frecce indicano i depositi di calcio in forma di noduli e di colore rosso acceso. Tale immagine, a scopo esemplificativo, mostra la produzione di calcio nel pellet cellulare coltivato nel medium condizionato con il polimero PP dopo 21 giorni. (ingrandimento 20X) I depositi di calcio, così colorati con Alizarin Red, erano coerenti con la produzione di ALP. I pellet cellulari in coltura coi medium condizionati con i tre polimeri da soli, così come per la produzione di ALP, erano i più ricchi di aggregati di calcio, come si può vedere nell’immagine rappresentativa riportata in Figura 11, in cui vi sono due sezioni di pellet, uno coltivato con il polimero PP e l’altro con la corrispondente putty. Figura 11. Depositi di calcio in pellet cellulari di cellule coltivati per 21 giorni in mezzo condizionato PP (a) e in terreno condizionato con stucco PP (b). Ingrandimento x20. Inoltre, considerando i risultati sulla produzione di ALP, si può osservare che i pellet cellulari coltivati in presenza di polimero PP presentavano una maggior produzione di calcio; questo significa che il polimero PP ha indotto maggior differenziazione. Discussione e conclusioni Questo lavoro di tesi ha portato allo sviluppo di formulazioni di binder polimerici alternativi a LEOL per una possibile futura MagnetOs Putty iniettabile. Le tre formulazioni, PP 1:10, GPP 1:10 e IN02, sono state selezionate dopo la loro sintesi e caratterizzazione come potenziali candidati e sono state studiate e confrontate al fine di ottenere il binder polimerico ottimale che rispondesse ai requisiti desiderati. Tra questi, il polimero PP 1:10 ha dimostrato di essere il più promettente per lo sviluppo della MagnetOs Putty iniettabile date le sue proprietà reologiche, termiche, di dissoluzione e biologiche in vitro. Questo può essere facilmente iniettato tramite una siringa adattandosi perfettamente al difetto osseo considerato, ha una buona abilità di contenimento dei granuli senza disperderli e non è né troppo oleoso né appiccicoso, favorendone il maneggiamento. Dal punto di vista biologico in vitro non si è rivelato citotossico per le cellule, al contrario ha dimostrato una buona citocompatibilità rispetto agli altri materiali utilizzati e rispetto anche al controllo negativo stimolando inoltre l’attività metabolica in termini di produzione di ALP e di calcio, ottimi indicatori per la differenziazione ossea. Ad oggi, non è ancora chiaro il motivo di questi migliori risultati, perciò bisognerà, in futuro, indagare questo aspetto in modo più approfondito mediante ulteriori caratterizzazioni biologiche in vitro. L’aggiunta di glicerolo ad esso non ha mostrato alcun miglioramento sostanziale; al contrario, rispetto a GPP 1:10, il binder PP 1:10 può essere prodotto con un processo di sintesi più semplice, breve e controllabile nonché con un componente in meno e le proprietà ottenute, seppur simili, sono migliori. A favore della selezione del polimero PP 1:10 rispetto a IN02 vi è il tempo di dissoluzione più lungo, ma pur sempre all’interno del periodo desiderato di 48 ore, che potrebbe concedere al chirurgo il tempo necessario per operare, facilitando il corretto posizionamento della putty durante l'intervento chirurgico e il mantenimento dei granuli in sito dopo l’operazione evitandone una migrazione. Sebbene la degradazione di PP 1:10 sia più lenta, porta comunque al rilascio di residui di tale polimero di dimensioni tali da poter essere eliminati dal corpo umano perché il loro peso molecolare è inferiore a 50 kDa [14]. Nonostante questi promettenti risultati, si suggerisce di lavorare ulteriormente per ottimizzare questi binder polimerici, testando le loro prestazioni da una prospettiva più industriale. Ad esempio, studi sugli effetti di una tecnica di sterilizzazione standard, come l’irraggiamento con raggi gamma, sul polimero, con potenziale peggioramento delle prestazioni di putty, o uno studio di shelf life della putty per valutare se il polimero influisce sulla morfologia e sulla chimica dei granuli di MagnetOs durante lo stoccaggio e il trasporto. Inoltre, dovrebbero essere condotti studi in vivo su animali in modelli di fusione vertebrale per valutare le prestazioni della putty rispetto agli autograft e valutare il potenziale accumulo di prodotti di degradazione negli organi bersaglio.