Engineering the perivascular haematopoietic niche on acellular splenic scaffold

Nowadays the demand for organs transplantation is increasing dramatically and despite the several improvements in the field, there is still a problem linked with donor organ shortage and all the complications related to life-long immunosuppression due to allogeneic transplantation, that lead to an increasing mortality. Regenerative medicine, and in particular tissue engineering has the important goal of replacing tissues and organs that are damaged or lose their functions. To do so, tissue engineering exploits the combination of cells, scaffolds and stimuli. Although it is a secondary lymphatic organ and patients can survive without it, complications linked to its removal may significantly reduce the quality of life, especially in case of paediatric patients. In fact, the spleen represents the main blood filter, which removes old erythrocytes, blood-borne pathogens and foreign material. It is also involved in iron metabolism and in the process of haematopoiesis, through which all blood cells and immune system cells are formed. Furthermore, all patients subjected to splenic removal are predisposed to overwhelming post-splenectomy sepsis and meningitis. In particular, paediatric patients are often required to undergo long-term prophylaxis with antibiotics. Therefore, the goal of the present project was to create an engineered splenic perivascular niche on decellularised scaffold and on extracellular matrix (ECM) derived hydrogel to support extramedullary haematopoiesis in splenectomised patients. In the present work, two different decellularisation approaches were compared: perfusion and agitation. Perfusion is used when the whole organ is accessible, while agitation is performed, when smashed spleen is the only available source. When the whole organ is available, in most cases from xenogeneic sources, it can be regenerated and reintroduced to the body to restore its physiological functions. Following the decellularisation process, smashed porcine spleen was lyophilised and then enzymatically solubilised with pepsin to obtain a pre-gel solution, which then forms a gel once neutralised at physiological conditions. The haematopoietic niche in the spleen is the place where EMH and haematopoietic stem cells (HSCs) are sustained. It has been already shown that is linked to sinusoidal blood vessels in the red pulp and that endothelial cells and stromal cells products, SCF and CXCL12 respectively, are key factors after EMH induction. Before testing more complex substrates, HSCs were seeded onto different endothelial feeder layers: one composed of HUVEC and the other one of E4ORF1+ ECs. Subsequently, ECs were seeded both into the hydrogel and the whole decellularised scaffold. The results obtained were satysfying in both experiments, in particular in the seeding of the whole spleen, where endothelial cells well attached and engrafted within the vascolature tree. Although some changes have to be done to improve the work, the overall results are very promising and make us closer to our final goal.

Nonostante i numerosi miglioramenti nel campo della medicina avvenuti negli ultimi decenmni, la richiesta di organi e tessuti da donatori per i trapianti continua ad aumentare e persistono i problemi legati alla ridotta disponibilità da donatore allogenico e alle complicanze connesse all’immunosoppressione. La Medicina Rigenerativa, in particolare l’Ingegneria dei Tessuti, ha lo scopo fondamentale di sostituire tessuti o organi, che hanno perso in parte o del tutto la loro funzione. Per ottenere tale obiettivo, l’ingegneria tissutale sfrutta la combinazione di tre elementi: cellule, scaffold e stimoli. Nonostante la milza sia un organo linfatico secondario e non vitale, le complicanze a lungo termine connesse alla sua rimozione, in caso di malattie primarie o secondarie, sono importanti come l’aumentata suscettibilità a rischio cardiovascolare o infettivo. Per tale motivo, i pazienti splenectomizzati sono sono spesso tenuti a subire profilassi con antibiotici a lungo termine e pertanto in particolare nel caso di pazienti pediatrici vi è un rischio di aumentare l’antibiotico resistenza di particolari batteri o in ogni caso un’inevitabile riduzione della qualità della vita. La milza, infatti, rappresenta uno dei principali filtri del sangue non solo di globuli rossi vecchi e/o danneggiati, ma anche di agenti patogeni presenti nel sangue o altro materiale estraneo. E' inoltre coinvolta nel processo di ematopoiesi, attraverso il quale sia le cellule del sangue sia le cellule del sistema immunitario vengono formate. L’obiettivo del seguente progetto è stato dunque quello di ingegnerizzare la nicchia perivascolare ematopoietica nella milza sia su organo decellularizzato sia su un hydrogel derivato da matrice extracellulare una cui possibile applicazione clinica potrebbe essere il ripristino dell’attività ematopoietica midollare in pazienti splenectomizzati. Nel seguente lavoro, due tecniche di decellularizzazione sono state confrontate: perfusione e agitazione. Il razionale alla base di questo confronto è che la prima è utilizzabile quando è disponibile l’intero organo con il suo supporto vascolare, mentre la seconda è applicabile quando l’integrità dell’organo è compromessa. In seguito al processo di decellularizzazione, il tessuto splenico è stato liofilizzato e successivamente digerito con pepsina per ottenere una soluzione viscosa nota come pre-gel, che a sua volta è stata neutralizzata a condizioni fisiologiche oer ottenere un hydrogel. Per analizzare le proprietà meccaniche del gel, ho effettuato delle analisi reologiche (amplitude e frequency sweep su tre differenti campioni, confermando che l’hydrogel prodotto seguisse l’andamento peculiare dei gel derivanti da matrice già studiati e analizzati in letteratura. La nicchia ematopoietica nella milza è il luogo dove resiedono le cellule ematopoietiche ed è sostenuta l’ematopoiesi extramidollare. E' stato dimostrato che la nicchia è collegata ai vasi sanguigni nei seni e che i prodotti secreti dalle cellule endoteliali e stromali, SCF e CXCL12 rispettivamente, sono fattori chiave nell’induzione dell’ematopoiesi splenica. Prima di testare substrati più complessi come il gel e lo scaffold decellularizzato, ho realizzato studi preliminari testando la crescita delle cellule staminali ematopoietiche su due diversi feeder layer: HUVECs e E4ORF1+ ECs. I risultati ottenuti confermano le premesse: le cellule staminali ematopoietiche si sono mostrate più proliferative sul feeder layer di cellule E4ORF1+ rispetto a quello costituito da HUVECs. Successivamente, abbiamo provato a replicare questo esperimento sia sul gel sia sull'intera milza decellularizzata, utilizzando cellule endoteliali anche in questo caso. I risultati ottenuti dalle colture sia su gel sia su intero scaffold decellularizzato sono stati molto soddisfacenti, in particolare in quest'ultimo caso, in cui le cellule endoteliali si sono disposte in modo omogeneo all'interno dell'albero vascolare. Questo rappresenta un risultato molto incoraggiante verso gli esperimenti di co-coltura con le cellule staminali ematopoietiche.