Process development for the expansion of early memory T cells in defined conditions

According to the World Health Organization, cancer is one of the leading causes of death worldwide. To overcome many of the limitations experienced by conventional treatments and with the aim to develop a more efficient-tumor-specific treatment, the concept of cell-based immunotherapy has gained increased attention. The idea behind this new strategy is to fight cancer by instructing a strong immune response towards it, usually with the infusion of lymphocytes instructed to recognize and destroy cancer cells. This thesis focuses on the expansion of human lymphocytes for cell-based-immunotherapy. It has been highlighted by many authors how the efficacy of this therapy is correlated with both the number and the phenotype of cells infused. Different authors identified early memory T cells as the most appealing subsets for adoptive cell-therapy due to their self-renewal and high proliferative capacity in vivo. This rare T cell subsets are highly sensitive to the protocol used during the expansion step, making their cultivation in vitro difficult to perform. Generally, the strategies adopted for their expansion maximize the growth rate at the expense of differentiation in short-lived effector cells. Moreover, the use of serum-enriched media boosts the expansion but due to its intrinsic variability reduces stability and reproducibility of the entire process. With the aim to develop a bioprocess for the expansion of early memory lymphocytes in vitro in defined conditions, we first focused on the design of a serum-free media able to support growth and phenotype maintenance, leading to the expansion of a population of CD27 +CD62L+ CCR7+ cells. Taking into account the high cells doses required for clinical application (i.e. 108 to 1010 cells), the second part of the project was focused on the identification of optimal physicochemical parameters such as pH, temperature and shear forces and their implementation in a scalable bioreactor-based platform. Our results show how the serum-free media formulation hereby developed supported the expansion of early memory lymphocytes and the possibility to move to a scalable 3D platform-system without reducing neither the growth rate nor the quality of the cells.

Il cancro è una delle maggiori cause di morte e nonostante i molti progressi fatti in termini di terapie sviluppate diversi sono gli effetti collaterali ad esse associati. Nell'ottica di un trattamento tumor-specific, il concetto delle immunoterapie sta acquistando sempre maggior interesse. L'idea di questo nuovo approccio consiste nell'istruire una forte risposta immunitaria diretta contro cellule tumorali. L'obiettivo di questo progetto è volto a sviluppare un processo per l'espansione di cellule T con fenotipo di early memory in condizioni definite. Diversi autori sottolineano come l'efficacia di queste terapie dipenda fortemente dal numero e dal fenotipo delle cellule infuse. Qualità come self-renewal e natura multipotente hanno fatto dei fenotipi early memory i candidati ideali per queste nuove terapie. La rarità di questo subset in vivo e l'impatto che gli stessi protocolli di espansione usati hanno sul fenotipo rendono difficile la loro coltivazione in vitro. Generalmente, i processi adottati per la produzione di cellule T terapeutiche tendono a massimizzare l’espansione delle cellule a spese della perdita del fenotipo memory. Con l'intento di sviluppare un bioprocesso riproducibile e consistente che permetta di espandere linfocity early memory in vitro, la prima fase del progetto si è focalizzata sul definire un medium serum-free per la loro coltivazione. Scindere il concetto di proliferazione e di differenziazione non solo è possibile, ma lavorando in condizioni definite consente di ottenere una popolazione cellulare formata per la maggiore da CD27 +CD62L+ CCR7+ cellule. Al fine di garantire l'efficacia del trattamento, le dosi richieste per applicazioni cliniche prevedono l'utilizzo di 108-1010 cells cellule. Pertanto, la seconda fase del lavoro è stata dedicata a delineare i valori ottimali di parametri come pH, temperatura e forze di shear tali da garantire la resa migliore in termini di espansione in un sistema di coltura 3D. I risultati ottenuti dimostrano che la formulazione del medium serum-free realizzata, unita all'ottimizzazione di un sistema di cultura dinamico, rendono possibile scalare l'intero processo promuovendo l’espansione di linfociti early memory.