Stability of therapeutic proteins : a nanoparticles-based assay for the identification of lead candidates in early stages

Protein stability is a key issue for the successful development of biotherapeutic products, such as monoclonal antibodies. One major physical instability is protein aggregation, which can greatly impair product development and shelf life, and therefore represents an important quality attribute to assess product developability. Among the many factors that can potentially trigger protein aggregation, it is well known that interactions with air-water interfaces and hydrophobic-hydrophilic interfaces are high-risk sources of instability. Here, we develop an accelerated stability assay that provides a highly controlled surface-mediated driving force for aggregation. The platform consists of polymeric nanoparticles that provide finely controlled and high surface-to-volume ratios. Leveraging on polymer chemistry we designed different nanoparticles with accurate surface properties, ranging from hydrophobic to hydrophillic to charged nanoparticles. We demonstrate that hydrophobic nanoparticles induce the aggregation of stable, large immunoglobulins in a time scale of few minutes. We studied the stability of an IgG1, an IgG2, an IgG4 and 13 variants of this IgG4 with this assay under different buffer conditions. Remarkably, we observed strong correlations between the extent of aggregation induced by our hydrophobic nanoparticles surface-stress assay (HNSSA) and other developability properties of the molecules, such as their solubility and aggregation upon long term storage at 40°C. Overall, these results suggest that this novel, highly controlled surface-stress assay of accelerated protein aggregation could complement the current set of techniques to assess the developability potential of monoclonal antibodies during the early stages of the process.

La stabilità proteica è un requisito cruciale per lo sviluppo di un prodotto bioterapeutico, quale un anticorpo. Uno dei maggiori ostacoli ad essa è l'aggregazione, che può diminuire in modo significativo la commercializzazione del prodotto e la shelf-life. Per accertare la sviluppabilità del prodotto è quindi fondamentale prevedere la stabilità all’aggregazione. Uno dei noti fattori di stress che inducono aggregazione sono le interfacce come quelle tra acqua aria, idrofobico idrofilico. Abbiamo dunque sviluppato un protocollo accelerato per testare la stabilità proteica basato sull'aggregazione indotta da superfici idrofobiche. Queste ultime sono fornite da nanoparticelle polimeriche che garantiscono un rapporto superficie-volume finemente controllato e, inoltre, la chimica polimerica ci permette di controllare con grande precisione le proprietà di superficie delle nanoparticelle. Dimostreremo quindi che queste nanoparticelle inducono l'aggregazione di un IgG1 stabile in una scala temporale di alcuni minuti. In seguito, abbiamo studiato la stabilità di un IgG2, un IgG4 e 13 varianti dell'IgG4 con il nostro protocollo sotto differenti condizioni di formulazione. Dal nostro lavoro è emerso come dato significativo una forte correlazione tra la quantità di aggregazione indotta dalle particelle idrofobiche e altre proprietà riconosciute come indici di sviluppabilità della molecola, tra cui la solubilità e l'aggregazione durante un esperimento di stabilità a lungo termine, incubando le molecole a 40°C. Complessivamente, questi risultati suggeriscono che questo nuovo protocollo, altamente controllato, di aggregazione proteica basato sulle superfici può integrare il corrente set di tecniche per definire la stabilità degli anticorpi durante gli step iniziali dello sviluppo di un nuovo anticorpo.