Electrical impedance spectroscopy for tumor tissue detection

Bioimpedance detection is a simple and innocuous way for electrical characterization of living tissues and detection of pathological states, e.g. cancer. In fact, the electrical properties of biologic tissues differ depending on their structure. Being bioimpedance a complex quantity, it depends on frequency of the stimulation signal. The Electrical Impedance Spectroscopy (EIS) allows to perform bioimpedance measurement both at a single frequency and along a frequency range. There are two possible configurations with which it’s possible to measure electrical impedance of a biologic sample: two electrodes configuration and four electrodes configuration. In this Master Thesis project Electrical Impedance Spectroscopy, with four electrodes configuration, has been taken into account for differentiation of different kinds of tissue. The first objective was to conduct an ex-vivo experimental protocol on explanted mammary tumors. The purpose of this study was to evaluate the effectiveness of a minimally invasive procedure to discriminate healthy and pathologic human tissues based on their different electrical impedance properties. The campaign started in December 2017 at Ente Ospedaliero Cantonale di Lugano, Switzerland, it will involve about 105 patients and it will last approximately 12 months. The number of selected patients has been chosen to conduct an analysis with an appropriate statistical meaning, but the study carried out in this project involved only 33 patients for time matters. A statistical analysis (two-way and three-way ANOVA tests) was conducted on the performed measurements and the results showed that EIS with four electrodes configuration could be considered a good tool to distinguish between cancerous cells and physiological cells. Despite the great potential of this technique, the device used to perform ex-vivo measurements on explanted mammary tumors which has been designed in a previous work during 2016 at Politecnico di Milano [19], presents several limitations. For this reason, the second objective of our work was to realize and to validate a new minimally invasive instrument, able to distinguish between different types of tissue, trying to solve all the problems linked to the old device. Each element of the entire apparatus has been analysed and improved, creating a new tool, which not only more appropriate for the current usage, but also closer to what could be the future application of this study, that is an endoscopic instrument for recognition, characterization and analysis of solid tumors. The entire device is composed by five functional parts: a needle probe that presents on the surface four measurement electrodes, the electronic instrumentation, the firmware to control the electronic instrumentation, the software user interface to select the stimulation parameters and the virtual instrumentation to compute the electrical impedance of the tissue under exam and for the online visualization of the results. This project evolution is articulated in the realization of each of these components. The main component of the hardware electronic instrumentation is the microcontroller CY8CKIT-059 PSoC 5LP Prototyping Kit, from the PSoC 5LP family. This chip integrates configurable analog and digital circuits, controlled by an on-chip microcontroller, providing the ability to design and modify, in every moment, a customized virtual hardware. Through the associated firmware implementation, the microcontroller receives the instructions from the software user interface, it generates the stimulation signal at the appropriate frequencies, it acquires data and it sends them to the virtual instrumentation for the impedance computation. Another part of the electronic instrumentation is the analog front-end that must ensure the complete matching of the impedance measurement system to perform reliable measurements. The measures are performed inside the frequency range between 1 KHz and 100 KHz, with two different simulation modalities. The first one, called single frequency modality, consists in the stimulation, of the sample under exam, with one frequency at time among those selected. Therefore, for each measure, the excitation signal is a single sinewave at a specific frequency. This modality can include the entire available frequency range, a smaller frequency range or single frequencies. In the second modality, called multifrequency modality, the excitation signal consists in sum of three sinewaves at different frequencies included between 20 KHz and 100 KHz. Both the user interface and the virtual instrumentation has been implemented via Pc, using NI LabVIEW® software. The first one needs for the selection of the stimulation parameters, the second one for the computation of impedance module and phase of the sample under analysis and for the online visualization of these results. Besides the online visualization, the results have been analyzed though MATLAB software in order to classify different types of tissue. The developed device was tested using different practical phantoms, developed with non-biological (saline solution 0.9% NaCl) and biological materials (different homogeneous area of porcine tissue). In particular, four electrodes sensing on homogeneous areas of muscle tissue and adipose tissue was used to verify if it was possible to distinguish different tissues though the analysis of acquired magnitude and phase values. A statistical analysis (two-way ANOVA test) was conducted on these results. Qualitative and quantitative analyses suggest that the instrument ca be used to discriminate two different tissues which has different composition and that different tissues can be better discriminated at certain frequencies rather than other. In particular, discrimination is more evident in the frequency range from 10 KHz to 100 KHz. The preliminary results obtained both on non-biological and biological samples look promising for future developments for studying the physiological status of ex-vivo human tissues in order to establish if the developed device could be capable of assessing surgical margin status based on the electrical property contrast between benignant and malignant tissue. This thesis work is organized in five Chapters: 1. the first Chapter introduces the concepts of bioimpedance and Electrical Impedance spectroscopy; 2. in the second Chapter the statistical analysis conducted at Ente Ospedaliero Cantonale di Lugano, Switzerland, on ex-vivo measurements on explanted mammary tumors, is described. Even the used instrument and the measure modality are presented; 3. in the third Chapter everything related to the design and the development of the new device is described in detail. In particular, the hardware specifications, the firmware and the software both of the user interface and of the virtual instrumentation are presented; 4. in the fourth Chapter the evaluation of the developed device is presented: used protocols and results of each test are reported; 5. the final Chapter is a conclusive overview about this thesis work. Besides the encountered limitations are shown and some future developments are proposed in order to improve the realized system.

La misura della bioimpedenza è una tecnica semplice e innocua per effettuare una caratterizzazione elettrica dei tessuti viventi e per la rilevazione di eventi patologici, come ad esempio la presenza di cellule cancerose. Infatti, le proprietà elettriche dei tessuti biologici differiscono a seconda delle caratteristiche strutturali degli stessi. Essendo la bioimpedenza una quantità complessa, essa dipende dalla frequenza del segnale di stimolazione. La Spettroscopia di Impedenza Elettrica (EIS) consente di effettuare la misura di bioimpedenza sia ad una frequenza fissa, sia lungo un range di frequenze. Esistono due possibili configurazioni con le quali è possibile misurare l’impedenza elettrica di un campione biologico: la configurazione a due elettrodi e la configurazione a quattro elettrodi. In questo progetto di tesi la Spettroscopia di Impedenza Elettrica, effettuata con configurazione a quattro elettrodi, è stata presa in considerazione per la differenziazione e la caratterizzazione di diversi tipi di tessuto. Il primo obiettivo è stato quello di condurre un protocollo di misure sperimentali ex-vivo su tumori al seno espiantati. Lo scopo di questo studio era quello di valutare l’efficacia di una procedura minimamente invasiva per la discriminazione di tessuti umani sani e patologici in base loro differenti proprietà di impedenza elettrica. La campagna è iniziata a Dicembre 2017 presso l’Ente Ospedaliero Cantonale di Lugano, in Svizzera, essa coinvolgerà circa 105 pazienti e durerà approssimativamente 12 mesi. Il numero di pazienti selezionate è stato scelto per poter condurre un’analisi con un appropriato significato statistico, ma lo studio condotto in questo progetto ha coinvolto solamente 33 pazienti per questioni di tempo. È stata condotta un’analisi statistica sulle misure effettuate (test ANOVA a due e a tre vie) e i risultati hanno mostrato che l‘EIS con configurazione a quattro elettrodi può essere considerato un valido strumento per distinguere cellule cancerose da cellule fisiologiche. Nonostante la grande potenzialità di questa tecnica, il dispositivo utilizzato per effettuare le misure ex-vivo sui tumori al seno espiantati, il quale è stato progettato in un lavoro precedente condotto nel 2016 presso il Politecnico di Milano [19], presenta grossi limiti. Per questo motivo, il secondo obiettivo di questo progetto di tesi è stato quello di realizzare e di validare un nuovo strumento minimamente invasivo in grado di distinguere differenti tipi di tessuto, cercando di risolvere tutti i problemi legati al vecchio strumento. Ogni elemento dell’intero dispositivo è stato analizzato e migliorato, creando un nuovo apparecchio, che risulta non solo più appropriato per l’uso corrente, ma anche più vicino a quella che potrebbe essere la futura applicazione di questo studio, ovvero uno strumento endoscopico per il riconoscimento, la caratterizzazione e l’analisi di masse tumorali. Il sistema completo è costituito da cinque parti funzionali: una sonda ad ago che presenta in superficie quattro elettrodi di misura, la strumentazione elettronica, il firmware per il controllo della strumentazione elettronica, l’interfaccia utente software per la selezione dei parametri di stimolazione e la strumentazione virtuale per il calcolo dell’impedenza del tessuto esaminato e per la visualizzazione in tempo reale dei risultati. L’evoluzione di questo progetto si articola nella realizzazione di ognuna di queste componenti. L’elemento principale della strumentazione elettronica hardware è un microcontrollore CY8CKIT-059 PSoC 5LP Kit di Prototipazione (Programmable System on a Chip), dalla famiglia PSoC 5LP. Questo chip integra circuiti analogici e digitali configurabili e fornisce la possibilità di progettare e modificare un hardware virtuale personalizzato. Attraverso l’implementazione del firmware associato il microcontrollore riceve le istruzioni dall’interfaccia utente software, genera il segnale di stimolazione alle frequenze appropriate, acquisisce i dati e li invia alla strumentazione virtuale per il calcolo dell’impedenza. L’altro componente della circuiteria hardware è il front-end analogico, che garantisce il completo adattamento del sistema di misura dell’impedenza per effettuare misure affidabili. Le misure vengono effettuate all’interno del range di frequenze tra 1 KHz e 100 KHz con due diverse modalità di stimolazione. La prima modalità, chiamata modalità a singola frequenza, consiste nella stimolazione del campione sotto esame con una frequenza alla volta tra quelle selezionate. Il segnale di eccitazione, per ogni misura, è perciò costituito da una singola sinusoide ad una determinata frequenza. Questa modalità di misura può avvenire lungo tutto il range di frequenze disponibile, in un range più piccolo o a singole frequenze. Nella seconda modalità, chiamata modalità multifrequenza, il segnale di eccitazione è costituito dalla somma di tre sinusoidi a frequenze diverse, comprese nel range tra 20 KHz e 100 KHz. Sia l’interfaccia utente sia la strumentazione virtuale sono state implementate tramite Pc, utilizzando il software NI LabVIEW®. La prima serve per la selezione dei parametri di stimolazione, la seconda per il calcolo di modulo e fase dell’impedenza del campione in analisi e per la visualizzazione online di questi risultati. Oltre alla visualizzazione online, i risultati vengono analizzati, al fine di effettuare una classificazione dei diversi tessuti, tramite il software MATLAB. Il dispositivo sviluppato è stato testato utilizzando dei phantom costruiti sia con materiali non biologici (soluzione fisiologica 0.9% NaCl), sia con materiali biologici (diverse aree omogenee di tessuto suino). In particolare, misure a quattro elettrodi su aree omogenee di tessuto muscolare e tessuto adiposo sono state effettuate per verificare che il dispositivo fosse effettivamente in grado di distinguere tessuti differenti, attraverso l’analisi dei valori di modulo e fase acquisiti. Un’analisi statistica (test ANOVA a due vie) è stata poi condotta su questi risultati. Le analisi qualitative e quantitative dei risultati consentono di affermare che il dispositivo può essere utilizzato per discriminare due diversi tessuti, che presentano composizione differente e che la discriminazione tra i diversi tessuti è più chiara in certi range di frequenze. In particolare, la discriminazione è più evidente nel range di frequenze che va da 10 kHz a 100 kHz. Questi risultati preliminari, ottenuti sia su campioni non biologici che su campioni biologici, sembrano promettenti per possibili sviluppi futuri volti a studiare lo stato fisiologico di tessuti umani ex-vivo, al fine di stabilire se il dispositivo realizzato possa essere utilizzato per valutare lo stato dei margini di resezione chirurgica, sulla base delle diverse proprietà elettriche mostrate da tessuti sani e patologici. Questo lavoro di tesi è organizzato in cinque Capitoli: 1. il primo Capitolo introduce il concetto di bioimpedenza e di Spettroscopia di Impedenza Elettrica; 2. nel secondo Capitolo viene descritta nel dettaglio l’analisi statistica condotta all’Ente Ospedaliero Cantonale di Lugano, in Svizzera, sulle misure ex-vivo di bioimpedenza effettuate su tumori al seno esportati. Viene anche presentato brevemente lo strumento utilizzato e le modalità di misura; 3. nel terzo Capitolo viene descritto nel dettaglio tutto ciò che riguarda la progettazione e lo sviluppo del nuovo dispositivo. In particolare, vengono presentate le specifiche hardware, il firmware e il software sia dell’interfaccia utente sia della strumentazione virtuale; 4. nel quarto Capitolo viene presentata la validazione del dispositivo sviluppato: sono riportati i protocolli utilizzati e sono presentati i risultati di ciascun test; 5. il Capitolo finale contiene una panoramica conclusiva su questo lavoro di tesi. Inoltre, vengono mostrati i limiti riscontrati e si propongono sviluppi futuri al fine di migliorare il sistema realizzato.