Development and optimization of organotypic microfluidic models of the osteoarthritic joint.

Osteoarthritis (OA), a disease characterized by joint degeneration and inflammation, affects more people than any other articular disease. Available symptomatic drugs are not able to counteract OA progression, which highlights the need for new disease modifying OA drugs. To this aim, a thorough knowledge of the mechanisms involved in OA pathogenesis should be pursued. The aim of this work was to develop and optimize two organotypic models to investigate inflammatory processes in the context of the OA joint. Since the synovial membrane of OA patients is characterized by macrophage accumulation due to an increased recruitment of monocytes from blood vessels, the first model was developed to investigate monocyte extravasation. The second model was instead developed to mimic the osteochondral interface and subsequently assess the effect of pro-inflammatory molecules on microvascular network formation in the bone compartment. Indeed, the invasion of vessels and subchondral bone into the cartilage compartment are hallmarks of OA that correlate with cartilage damage and osteophyte formation. The monocyte extravasation model comprises three compartments resembling the synovial membrane comprised of a post-capillary venule, articular cartilage and synovial cavity. The post-capillary venule is mimicked by an endothelialized channel, while synovial membrane and cartilage are modeled by primary synovial fibroblasts and chondrocytes embedded in fibrin gel. Once optimized the culture conditions, the system was validated by monitoring the extravasation of monocytes from the endothelialized channel to the synovial compartment in response to a known monocyte chemoattractant. We also showed that physiologically-relevant shear stress conditions induce the expression of adhesion molecules in endothelial cells. Finally, we used the system to generate a patient-specific model using patient-derived primary cells and synovial fluid and monitoring monocyte extravasation in response to synovial fluid. The osteochondral model comprises two gel compartments in direct contact with each other to mimic cartilage and bone. Cartilage was modeled with primary chondrocytes embedded in fibrin, while bone was modeled by embedding osteoblasts, osteoclasts and endothelial cells in a fibrin gel enriched with calcium phosphate nanoparticles. First, we optimized the conditions to co-culture all the different cell types and to achieve the formation of a microvascular network in the bone compartment. Afterwards, we exploited the model to investigate the effect of Interleukin-1β on microvascular network formation, showing that the branching and morphology of the network is affected by the inflammatory environment. The developed organotypic models hold a great potential for the investigation of different biological mechanisms involved in joint degeneration and OA pathogenesis and will be exploited in the future to test anti-chemokine drugs to limit monocyte extravasation and to investigate the crosstalk between cartilage and bone cells in response to inflammatory molecules.

L'artrosi, una patologia caratterizzata da degenerazione e infiammazione articolare, colpisce più persone di qualsiasi altra patologia articolare. Attualmente, il trattamento farmacologico dell’artrosi si basa su farmaci sintomatici che non sono in grado di contrastarne la progressione, evidenziando la necessità di sviluppare nuovi farmaci. A tale scopo, è necessario perseguita una conoscenza approfondita dei meccanismi coinvolti nella patogenesi dell’artrosi. Lo scopo di questo lavoro è lo sviluppo e l’ottimizzazione di due modelli organotipici microfluidici per studiare i processi infiammatori nel contesto dell'articolazione artrosica. Poiché la membrana sinoviale dei pazienti affetti da artrosi è caratterizzata da un accumulo di macrofagi causato a sua volta da un aumento del reclutamento di monociti dai vasi sanguigni, il primo modello è stato sviluppato per studiare l’extravasazione dei monociti. Il secondo modello è stato invece sviluppato per riprodurre l'interfaccia osteocondrale e successivamente valutare l'effetto di molecole pro-infiammatorie sulla formazione del network microvascolare nel compartimento osseo. Infatti, l'invasione dei vasi e dell'osso subcondrale nel tessuto cartilagineo sono segni distintivi dell’artrosi che correlano con la degenerazione della cartilagine e la formazione di osteofiti. Il modello di extravasazione dei monociti comprende tre compartimenti che mimano la membrana sinoviale compresa una venula post-capillare, la cartilagine articolare e la cavità sinoviale. La venula post-capillare è stata riprodotta mediante un canale endotelializzato, mentre la membrana sinoviale e la cartilagine sono state riprodotte mediante fibroblasti sinoviali e condrociti seminati in gel di fibrina. Una volta ottimizzate le condizioni di coltura, il sistema è stato validato monitorando l’extravasazione dei monociti dal canale endotelializzato al compartimento sinoviale in risposta a un noto fattore chemiotattico. Abbiamo anche dimostrato che condizioni di shear stress fisiologicamente rilevanti inducono l'espressione di molecole di adesione nelle cellule endoteliali. Infine, abbiamo utilizzato il sistema per generare un modello paziente-specifico utilizzando cellule primarie e fluido sinoviale derivate dal medesimo paziente e monitorando l’extravasazione dei monociti in risposta al liquido sinoviale. Il modello osteocondrale comprende due compartimenti di gel in diretto contatto l'uno con l'altro per mimare la cartilagine e l'osso. La cartilagine è stata riprodotta con condrociti primari seminati in gel di fibrina, mentre l'osso è stato riprodotto incorporando osteoblasti, osteoclasti e cellule endoteliali in un gel di fibrina arricchito con nanoparticelle di calcio-fosfato. In primo luogo, abbiamo ottimizzato le condizioni per la co-coltura dei diversi tipi di cellule e per ottenere la formazione di un network microvascolare nel compartimento osseo. Successivamente, abbiamo sfruttato il modello per studiare l'effetto dell'interleuchina-1β sulla formazione del network microvascolare, dimostrando che la ramificazione e la morfologia del network sono influenzate dall'ambiente infiammatorio. I modelli organotipici sviluppati hanno un grande potenziale per lo studio di diversi meccanismi biologici coinvolti nella patogenesi dell'artrosi e saranno utilizzati in futuro per testare farmaci anti-chemochina al fine di limitare l’extravasazione dei monociti e per studiare il crosstalk tra cellule della cartilagine e dell’osso in risposta a molecole infiammatorie.