Ultra fast pump probe spectroscopy in the ultra violet wavelength region.

This thesis is focused on the development of a pump-probe spectroscopy setup in the ultraviolet, in order to study the dynamical response of important biomolecules. Pump-probe spectroscopy is a widely used ultrafast spectroscopic technique which provides valuable information on the nature and dynamics of photogenerated species in solids and molecules. By correlating the information content of the differential transmission signal for different probing wavelengths, pump-probe allows to measure spectral diffusion, couplings and energy transfers between energy levels. It has been successfully implemented in the infra-red and visible ranges. In the ultraviolet range, where most biomolecules absorb, it is expected to provide important information about the ultra-fast dynamics and structural conformations of molecules such as DNA and proteins. The extension of pump-probe to the ultraviolet range although is not straightforward, because the technical difficulties become more challenging in this wavelength range. UV pulses are more energetic and could induce higher dispersion losses and higher order non linear effects. In the first chapter will be discussed the propagation of ultra-short pulses in a dispersive medium, and several non-linear optical generation processes that will be exploited in the setup. In the second chapter pump-probe is briefly explained, detailing the efforts done up to now to extend the technique to the ultraviolet range. The hyperspectral broadband pump probe experimental configuration is also presented, referring to all the non-linear processes presented in the previous chapter. After these introductory chapters, the employed setup is described, which is based on the pump-probe technique using excitation with tunable ultra short pump pulses in the UV. This allows us to obtain a set of transient absorption maps resolved in time, as a function of the detection frequencies, which contains information regarding both the absorption bands and the lifetimes of the energetic levels of the sample. The pump pulses are tunable in the 270 - 300 nm ultraviolet range, allowing us to excite electronic transitions in the test samples (Tryptophan, Azurin), while the probe can be chosen between a visible or ultraviolet white light continuum, covering the whole 300 - 700 nm range. In the fourth chapter we show results of measurements made to test the setup performance. Time-resolved pump-probe measurements are performed on Tryptophan and are accurately matched with the available experimental results. Lastly, starting from the analysis of a single aminoacid (tryptophan), we follow this with the measurement of a tryptophan-based metallo-protein (Azurin). By employing pump-probe measurement the aim is to investigate the differences between the Tryptophan alone dissolved in water as aminoacid and the mechanisms which appear when it is incorporated in more complex systems, such as the presence of a ligand to metal charge transfer (LMCT) absorption band in the Azurin spectrum of absorption.

Questa tesi è incentrata sullo sviluppo della spettroscopia pump probe nell'ultravioletto, al fine di studiare la struttura di importanti biomolecole. La spettroscopia pump probe è una tecnica spettroscopica ultraveloce, risolta in tempo e ampiamente utilizzata, che fornisce preziose informazioni sulla natura e la dinamica dei solidi e delle molecole, dopo che hanno subito un’eccitazione fotonica. Correlando il contenuto informativo del segnale di trasmissione differenziale per diverse lunghezze d'onda di sondaggio, questa tecnica spettroscopica consente di misurare la diffusione spettrale, gli accoppiamenti e i trasferimenti di energia tra i vari stati energetici presenti nel sistema. E' stato implementato con successo nelle regioni di frequenza infrarossa e visibile. Nella regione spettrale dell’ultravioletto, dove la maggior parte delle biomolecole assorbono energia, si prevede che forniscano informazioni importanti su dinamica ultraveloce e conformazioni strutturali di molecole complesse come il DNA e le proteine. L'estensione della spettroscopia pump probe all’ultravioletto non è semplice, poiché le difficoltà tecniche ne rendono più impegnative le realizzazioni sperimentali. Impulsi ultravioletti infatti presentano alte energie e possono causare ingenti dispersioni e perdite. Nel primo capitolo verrà discussa la propagazione degli impulsi ultra-corti in un mezzo dispersivo e diversi processi di generazione ottica non lineare che saranno sfruttati in seguito nella configurazione sperimentale. Nel secondo capitolo la tecnica pump probe è brevemente spiegata, ponendo maggiore attenzione su una configuratione spettroscopica a banda larga, dove l’impulso di probe è bianco, quindi possiede svariate frequenze. Dopo questi capitoli introduttivi, viene descritta la configurazione impiegata, che è basata sulla tecnica pump-probe mediante eccitazione sintonizzabile di impulsi ultrabrevi nell'UV. Questo ci consente di ottenere una serie di mappe di assorbimento risolte in tempo, in funzione delle frequenze di test (probe), che contengono informazioni riguardanti sia le bande di assorbimento che i tempi di vita dei livelli energetici del campione. Gli impulsi della pompa sono sintonizzabili nel regime dei raggi ultravioletti tra 260-300 nm , il che consente di eccitare transizioni elettroniche nei Campioni da studiare (Triptofano, Azurrina), mentre la sonda può essere scelta tra un continuum a luce bianca visibile o ultravioletta, coprendo l'intero spettro tra 300 - 700 nm. Nel quarto capitolo mostriamo i risultati delle misurazioni effettuate per testare la configurazione e le relative prestazioni. Le misurazioni pump probe risolte in tempo sono eseguite su Triptofano e sono accuratamente abbinate ai risultati sperimentali disponibili. Infine, a partire dall'analisi di un singolo amminoacido (triptofano), seguiamo ciò con la misura di una metalloproteina a base di triptofano (Azurrina). Utilizzando la misurazione pump probe, lo scopo è quello di indagare le differenze tra il triptofano da solo disciolto in acqua come amminoacido e i meccanismi che compaiono quando esso è incorporato in sistemi più complessi. Esempio di ciò è la comparsa di una banda di assorbimento nello spettro dell'azzurrina, indicatrice di un trasferimento elettronico tra metallo e molecola organica(LMCT).