Electrophoretic Deposition for Bottom-up design of cellular solids in biomedical applications

Electrophoretic Deposition (EPD) has been proposed as a fabrication technology for self-standing structures based on biopolymers. Thin or thick films, deposited in an ordered fashion under suitable conditions, can be easily peeled-off the substrate replicating the working electrode morphology. By coupling EPD with replica-approach, structures with controlled three-dimensional morphology can be obtained. EPD is a convenient, cost effective, and efficient bottom-up technology, recently proposed as a novel method for the fabrication of scaffolds and coatings. In this thesis, we present the first successful effort to fabricate cellular solids via a combination of EPD, replica technique. The prospective of such approach by using chitosan as a model polymer, further functionalized for specific applications, has been demonstrated. In this thesis EPD has been exploited to generate different combinations of bio polymer/bioactive agent on metallic substrates with the aim of enhancing bioactive characters, drug delivery abilities and minimizing infection. To begin with, hierarchic micro-patterned porous scaffolds via electrochemical replica-deposition, fabricated to fulfill bio-applications. In the following, to support the bioactive character of the coating for bone tissue regeneration, EPD bioactive composite was obtained. Furthermore, passive and active drug delivery systems for oral application and orthopaedic antibacterial implants designed, respectively. Biopolymer micro-structuring Hierarchic micro-patterned porous scaffolds which are produced by electrochemical replica-deposition, designed to enhance neo-vascularization. Furthermore, biopolymer micro-structured patches for dermal regeneration was evaluated. This study supports the general idea that patterns of micro-channels enhance intra-scaffold neovascularization and promote tissue regeneration. At in vitro tests, endothelial cells firmly adhered to the highly cytocompatible substrates during migration, with a cell density that was modulated by the scaffold micropattern. It was particularly favored by precisely-designed micro-channels. When such micro-patterned scaffolds were implanted in vivo, neo-vascularization resulted enhanced, in comparison to random-pore scaffolds. In continue, a novel approach to design patterned-chitosan (CS) scaffolds by electrophoretic deposition (EPD) which can effectively induce the regeneration of dermis in an animal model of skin loss was developed. To evaluate the effect of patterned scaffolds on dermal regeneration, single layer chitosan porous scaffolds of flat (no pattern), circular pattern with Φ = 500 µm and 1 mm were fabricated and used to treat full-thickness wounds in a one-stage grafting procedure in a rat model. Taken together, this animal test may represent an alternative pre-clinical screening tool to evaluate novel in vivo therapeutic strategies. Furthermore, the CS scaffolds evaluated in this study was clinically effective, suggesting the potential for this strategy as a therapeutic intervention to reconstruct the skin. Bioactive composites Bioactive ceramics, e.g. 45S5 bioactive glass (BG) was applied in this study. It is promising bone substitute material which was investigated to support the bioactive character of the coating for bone tissue regeneration, an enhanced bone-to-implant interaction as well. The polymer component considered in this PhD thesis, e.g. chitosan, will not only strengthen the bonding of bioceramics coating to the surface of the implant, but also offer the possibility to control the in-situ release of dissolution products and can accelerate the attachment of biomolecules and cells by the presence of functional groups. A multilayer coating, considered to impart the osteoconductivity and other intended biomedical properties, was successfully fabricated via a combination of EPD and thin sheet lamination additive manufacturing. The aim of this project, which focused on exploiting the EPD technique to fabricate biomedical coatings with specific functions, oriented porous structures and self-standing membranes for emerging biomedical applications, was achieved and a series of new coating systems, well characterized and exhibiting combination of favorable properties, are thus available for further applications and dedicated in vivo evaluations. Drug Delivery Systems A series of coatings with different combination of inorganic agents and biopolymer matrix were successfully fabricated by EPD from aqueous based and ethanol-based suspensions at room temperature. The co-deposition systems produced and characterized in this thesis were CS/Clobetasol Propionate (CP) and CS/ Gallium (Ga). The co-deposition mechanisms were experimentally investigated, and the coating properties were comprehensively assessed by means of relevant material characterizations and cell biology and microbiology tests. The coating properties, including degradation, adhesion and drug (or inhibitor agent) release profiles, which are key factors for an effective and sustained antibacterial effect, were optimized and validated. In this thesis, a novel class of biopolymer-based patches in which anti-inflammatory steroidal agent (CP) is loaded via electrophoretic deposition has been developed. Ethanol-based deposition bath was used to allow one pot deposition process of the hydrophobic CP drug, together by modulating the amount of CP in order to design a platform of drug delivery systems. Despite notable success of metallic orthopaedic prosthesis in clinical, their long-term survivability remains a major challenge due to the lack of osteoconductivity and risks associated with post-surgery infections and surface corrosion. Modification of implant surfaces with bioactive materials and antimicrobial agents is being intensively investigated to prevent these negative effects. Last but not certainly least, in this thesis, EPD as a convenient coating technique has been developed to generate different combinations of biopolymer-inorganic coatings (CS/Ga) on metallic substrates with the aim of enhancing bioactive characters and minimizing infections.

La deposizione elettroforetica (EPD) è una nota tecnologia di fabbricazione per strutture self-standing a base di biopolimeri. Film di spessore variabile, depositati con una struttura ordinata in condizioni definite, possono essere facilmente staccati dal substrato di deposizione replicandone la morfologia. Inoltre, coniugando l’EPD con un approccio a replica, è possibile ottenere strutture con una morfologia tridimensionale desiderata e controllata. L’EPD è una tecnica conveniente, di costo contenuto e basata su un approccio bottom-up, recentemente utilizzata anche nel settore della fabbricazione di scaffold e per l’ottenimento di coating. In questa tesi, per la prima volta, viene proposto l’uso della tecnica EPD, accoppiato con un approccio a replica, per l’ottenimento di solidi cellulari. Nella tesi vengono dimostrate le possibili prospettive di questo approccio, usando il chitosano come modello di polimero, ulteriormente funzionalizzato per applicazioni specifiche. In questa tesi, la tecnica EPD viene utilizzata e studiata per produrre diverse combinazioni di bio-polimero e agenti bioattivi su substrati metallici, con lo scopo di aumentarne le caratteristiche di bioattività, verificarne il possibile rilascio di farmaco e minimizzare i fenomeni di infezione. Innanzitutto, sono state prodotti scaffold porosi con microstruttura gerarchica, al fine di soddisfare i requisiti per le applicazioni nel settore biomedicale. Successivamente, sono stati ottenuti dei coating bioattivi attraverso EPD, per promuoverne la bioattività per la rigenerazione di tessuto osseo. Inoltre, sono stati ottenuti sistemi passivi e attivi a rilascio di farmaco per applicazioni di medicina orale e per l’ottenimento di impianti ortopedici antibatterici. Micro-strutturazione del biopolimero Scaffold porosi con micro-strutturazione gerarchica sono stati ottenuti attraverso replica del processo EPD, al fine di promuovere la neo-vascolarizzazione. Inotlre, patch a base di biopolimero micro-strutturato sono stati ottenuti per applicazioni di rigenerazione del derma. Questa parte di studio ha il fine di supportare l’ipotesi che la presenza di micro-canali possa aumentare la neo-vascolarizzazione interna dello scaffold e promuovere la rigenerazione tessutale. Secondo i test in vitro eseguiti, è stato dimostrato che cellule endoteliali aderiscono al substrato citocompatibile durante la migrazione, con una densità cellulare modulata dalla micro-strutturazione dello scaffold. In particolare, questo è stato promosso maggiormente dalla presenza di micro-canali finemente disegnati. A seguito dell’impianto in vivo di questi scaffold microstrutturati, è stata identificata una promozione della neo--vascolarizzazione, rispetto agli scaffold caratterizzati da una distribuzione random dei pori. In seguito, è stato sviluppato uno scaffold di chitosano, ottenuto attraverso EPD, che fosse in grado di rigenerare effettivamente il derma in un modello animale di perdita di pelle. Per verificare l’effetto degli scaffold caratterizzati da pattern sulla rigenerazione del derma, sono stati fabbricati scaffold porosi di chitosano costituiti da un unico layer continuo (no pattern), pattern circolari con Ø = 500 m e 1 mm ed utilizzati per trattare ferite full-thickness attraverso una procedura di grafting one-step in un modello animale di ratto. Questo test su modello animale può rappresentare un’alternativa di screening pre-clinico per testare in vivo nuove strategie terapeutiche. Inoltre, gli scaffold in chitosano studiati in questa tesi sono clinicamente efficaci, provando il potenziale di questa strategia come intervento terapeutico per la ricostruzione della pelle. Composti bioattivi In questo studio, ceramiche bioattive, e.g. vetri bioattivi 45S5, sono state considerate. Questo promettente materiale per sostituto osseo è stato studiato per testare il carattere bioattivo del coating per la rigenerazione di tessuto osseo, così come per un miglioramento dell’interazione osso-impianto. La componente polimerica considerata in questa tesi di Dottorato, i.e. chitosano, non solo rafforza il legame del coating di bioceramica alla superficie dell’impianto, ma offre anche la possibilità di rilascio in situ dei prodotti di dissoluzione e può accelerare l’adesione di biomolecole e cellule grazie alla presenza di gruppi funzionali. Un coating a più strati è poi stato prodotto al fine di impartire osteoconduttività e altre proprietà biomedicali al materiale, combinando EPD e thin sheer lamination additive manufacturing. Lo scopo di questa parte di tesi, focalizzata sull’uso della tecnica EPD per produrre coating biomedicali con specifiche funzioni, sull’ottenimento di strutture porose orientate e membrane self-standing per applicazioni biomedicali, è stato raggiunto e una serie di nuovi sistemi di coating, ben caratterizzati e aventi una combinazione di proprietà ottimali, sono ora disponibili per ulteriori applicazioni e caratterizzazioni in vivo. Sistemi a rilascio di farmaco Una serie di coating a diversa combinazione di agenti inorganici e matrici biopolimeriche sono stati ottenuti con successo attraverso EPD da sospensioni a base di acqua e a base di etanolo, a temperatura ambiente. I sistemi di co-deposizione prodotti e caratterizzati in questo lavoro di tesi sono chitosano/Clobetasol Propionate (CP) e chitosano/gallio (Ga). I meccanismi di co-deposizione sono stati ampiamente caratterizzati sperimentalmente, e le proprietà dei coating sono state testate attraverso caratterizzazione dei materiali, caratterizzazione biologica e microbiologica. Le proprietà dei coating, incluse degradazione, adesione e rilascio di farmaco (o agenti inibitori), caratteristiche fondamentali per un efficace ed efficiente effetto antibatterico, sono state ottimizzate e validate. In questa tesi, è stata sviluppata una nuova classe di patch a base di biopolimero in cui agenti steroidei antiinfiammatori sono stati caricati attraverso deposizione elettroforetica. La deposizione in bagno di etanolo è stata utilizzata per permettere deposizione one-pot del farmaco CP idrofobico, modulando allo stesso tempo la quantità di CP al fine di disegnare una piattaforma per sistemi a rilascio di farmaco. Nonostante il notevole successo delle protesi ortopediche metalliche in applicazioni cliniche, il loro successo nel lungo-termine rimane ad oggi una sfida, a causa della mancanza di osteoconduttività e i rischi associati alle infezioni post-impianto e alla corrosione superficiale. La modifica delle superfici degli impianti con materiali bioattivi e agenti antimicrobici è stata ampiamente studiata per prevenire questi effetti indesiderati. Infine, in questa tesi, l’EPD è stato dimostrato essere una conveniente tecnica di coating per sviluppare diverse combinazioni di biopolimero-coating inorganico (CS/Ga) su substrati metallici con lo scopo di promuoverne le caratteristiche bioattive e minimizzare i fenomeni di infezione.