Fluorescent transcription factors as tools to evaluate the influence of mechanical stimuli on nuclear import

Mesenchymal stem cell (MSCs)-based therapy is a promising strategy to regenerate injured tissues and regulate immune responses. The challenges concerning the clinical application of MSCs injection are mainly related to the reduced post-transplantation cell survival and the low control of MSC fate. Recent advancements focused on MSC response by studying their mechanotransduction, that is the mechanism by which MSCs transduce environmental mechanical inputs into chemical signals. The NICHOID project started in 2015 with the goal to verify the hypothesis that MSC key mechanisms, such as differentiation, are regulated by stretched-dependent nuclear import of specific transcription factors. According to this hypothesis the nuclear pores are mechanically sensitive elements and respond to cell stretching with nuclear pore enlarging and increased nuclear import of transcription factors. The experimental validation of the NICHOID hypothesis is based on the nuclear import rate measurement of transcription factors able to promote MSC differentiation. The aim of my Ph.D. thesis was to engineer transcription factors to achieve fluorescent tools to allow the nuclear import rate assessment in different MSC stretching conditions. To reach my goal, I designed, purified and validated five fluorescent transcription factor variants. The transcription factor experimentally selected was a promoter of myogenesis, MyoD (Myoblast determination protein). Five variants of MyoD were purified, each fused to a different fluorescent protein (probe): Tat-GFP, (-30)GFP, PAGFP, PAmCherry, mEOS3.2. Each variant of MyoD presented a peculiar characteristic: Tat-GFP-MyoD and (-30)GFP-MyoD followed specific protein transduction-based delivery procedures while MyoD-PAGFP, MyoD-PAmCherry and MyoD-mEos3.2 were sensible to photoactivation or photoconversion. The validation of the fluorescent molecules required analysis of protein localization by fluorescence confocal microscopy, nucleocytoplasmic transport measurement by fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) method and transcription promoting activity assay by real-time PCR. The results showed that the fluorescent variant of MyoD best representing the physiology of the native MyoD is the MyoD-PAGFP. (-30)GFP-MyoD resulted a suitable tool for nucleocytoplasmic transport measurement but real-time PCR results highlighted an inhibitory effect on MyoD functionality. Key experimental evidence of the fluorescent transcription factors was deepened with computational investigations. In particular, I used molecular dynamics (MD) to assess the (-30)GFP inhibition effect observed during the transcription promoting activity analysis. I used MyoD-PAGFP as negative control in MD simulation. (-30)GFP and PAGFP 3D models were generated by homology modeling, while in the case of MyoD protein, the 3D structure of the basic helix loop helix (BHLH) DNA binding domain was the only available. The goal of MD analyses was to verify if the presence of the peculiar major negative surface charge of (-30)GFP could interact with BHLH domain of MyoD, thus altering its functionality. Considering the bias of the lacking part of the MyoD structure, I generated four different configurations by positioning the BHLH domain of MyoD in different positions in respect to the fluorescent protein, so that the interface between the two molecules was different in every simulation. When analyzing root mean square deviation (RMSD) data and non-bonded interaction energies, results showed that (-30)GFP interacted more strongly with the monomer of MyoD in comparison to PAGFP. Furthermore, structural analyses showed that the interactions between (-30)GFP and MyoD were mainly mediated by negative and positive residues, respectively. In conclusion, in this Ph.D. thesis, I developed and assessed several potential tools for nucleocytoplasmic transport measurement. Among the fluorescent variants of MyoD, the photoactivatable MyoD-PAGFP is the tool that best resembles the properties of the native transcription factor and it is suitable for further nuclear import measurement. Otherwise, (-30)GFP-MyoD showed great properties in terms of protein delivery and nucleo-cytoplasmic shuttling. In this variant, MD simulations suggested an interference mechanism based on a strong interaction between MyoD and (-30)GFP that could explain the inhibition of MyoD activity. Overall, my work demonstrated that, the design and the development of the fluorescent probes in an intracellular dynamics study are fundamental steps to deeply understand their possible applications.

La terapia cellulare basata sull’utilizzo di cellule staminali mesenchimali (MSCs) è una strategia promettente sia nell’ambito della rigenerazione di tessuti danneggiati, sia nella regolazione delle risposte immunitarie. Le problematiche che riguardano l’applicazione clinica delle MSCs sono soprattutto relative alla ridotta sopravvivenza cellulare post-trapianto e al basso controllo della risposta cellulare. Per capire meglio il comportamento cellulare, studi recenti si sono focalizzati sul meccanismo di meccanotrasduzione, ossia il meccanismo attraverso il quale le MSCs transducono un segnale meccanico in un segnale chimico. Il progetto NICHOID è iniziato nel 2015 con lo scopo di verificare se l’import nucleare di fattori specifici sia un meccanismo dipendente dallo stress meccanico e se questo influenzi meccanismi chiave delle MSCs, come il differenziamento cellulare. La validazione sperimentale dell’ipotesi del progetto NICHOID si basa su misure di import nucleare di fattori di trascrizione promuoventi il differenziamento delle MSCs. L’obbiettivo del mio progetto di dottorato è quello di ingegnerizzare fattori di trascrizione ed ottenere molecole fluorescenti che permettano la misura del flusso di import nucleare in diverse condizioni di stress cellulare di tipo meccanico. Per raggiungere il mio scopo, ho disegnato, sviluppato e validato cinque varianti di fattori di trascrizione fluorescenti. Il fattore di trascrizione ingegnerizzato è MyoD (Myoblast Determination protein), un fattore che promuove la miogenesi delle MSCs. Ho fuso MyoD a cinque diverse sonde fluorescenti: Tat-GFP, (-30)GFP, PAGFP, PAmCherry, mEOS3.2. Ciascuna variante presenta caratteristiche peculiari: Tat-GFP-MyoD e (-30)GFP-MyoD sono proteine in grado di attraversare la membrana plasmatica; MyoD-PAGFP, MyoD-PAmCherry e MyoD-mEos3.2 sono varianti sensibili alla fotoattivazione o alla fotoconversione. La validazione delle molecole fluorescenti ha richiesto sia un’analisi della localizzazione intracellulare delle proteine, effettuata mediante microscopia confocale a fluorescenza, sia la misura di trasporto nucleo-citoplasmatico attraverso la tecnica FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) e infine il saggio di attività trascrizionale attraverso real-time PCR. I risultati hanno mostrato che la variante di MyoD che mostra meglio la fisiologia e le proprietà della proteina nativa è MyoD-PAGFP. (-30)GFP-MyoD è risultata efficace per lo studio del trasporto nucleo-citoplasmatico, ma ha mostrato un effetto inibitorio per quanto riguarda l’attività trascrizionale. Per implementare la validazione sperimentale dei fattori di trascrizione fluorescenti ho approfondito alcuni aspetti utilizzando le tecniche computazionali di dinamica molecolare. In particolare ho voluto approfondire l’effetto inibitorio osservato da parte della (-30)GFP nei confronti di MyoD. Per omologia, ho generato i modelli 3D di (-30)GFP e PAGFP. Nel caso del modello di MyoD è stato possibile ottenere solamente la struttura 3D del dominio Basic Helix Loop Helix (BHLH) coinvolto nel legame al DNA. L’obbiettivo delle analisi di dinamica molecolare è stato quello di verificare se la presenza di una maggiore carica negativa sulla superficie della (-30)GFP potesse determinare un’interazione della proteina fluorescente con il dominio BHLH di MyoD, ricco in cariche positive, alterandone la funzionalità. Avendo a disposizione la struttura 3D solamente del dominio di legame al DNA, ho generato quattro possibili configurazioni e quindi, quattro possibili interfacce del dominio BHLH di MyoD rispetto a (-30)GFP o PAGFP. Analizzando la radice dell’errore quadratico medio (RMSD) e l’energia di interazione di non legame, i risultati hanno dimostrato che la (-30)GFP tende ad interagire con il dominio BHLH di MyoD in modo molto più forte rispetto alla PAGFP. Inoltre, sia le analisi strutturali che i dati energetici hanno suggerito un meccanismo guidato da una forte interazione di carica. In conclusione, in questa tesi di dottorato, ho sviluppato e validato diverse molecole per lo studio del trasporto nucleo-citoplasmatico. Tra le varianti fluorescenti di MyoD analizzate, la variante fotoattivabile MyoD-PAGFP è la molecola che rispetta al meglio le proprietà del fattore di trascrizione nativo ed è il candidato migliore per le future analisi di import nucleare. Nonostante l’effetto controverso riguardante l’attività trascrizionale, (-30)GFP-MyoD ha mostrato buone proprietà in termini di rilascio intracellulare e di trasporto nucleo-citoplasmatico. Come suggeriscono le simulazioni di dinamica molecolare, l’effetto inibitorio sull’attività trascrizionale potrebbe essere dovuto ad un meccanismo di interferenza basato su una forte interazione di carica tra la (-30)GFP e MyoD. Come emerge dai risultati, lo sviluppo e l’applicazione di specifiche molecole fluorescenti è un passaggio determinante nello studio di meccanismi di dinamica intracellulare.