Innovative strategies to control cell fate and gene delivery behaviour

It is common knowledge that cells are naturally exposed to a multitude of stimuli in their surroundings that actively participate in determining the in vivo cell behaviour and fate. The control of cell behaviour and fate in vitro is possible through the design of biomaterials and tools with specific properties able to sustain and regulate cell adhesion, proliferation and even differentiation. Science is making great efforts to recapitulate the complex scenario of the cellular microenvironment to study cell behaviour and fate, and to this aim, several approaches such as surface modifications with topographical cues and/or chemical functionalities, and gene delivery, can be adopted. The main objective of the present thesis is the development of innovative strategies to control cell behaviour and fate: i) sol-gel chemistry has been applied for the functionalization of glass surfaces with different chemistries and variable amounts of thiols to study these groups as mediators of cell adhesion and functions; ii) a microfluidic platform was validated to trap, culture and transfect small cell populations, and for the fast screening of transfectants performances. Several strategies have been adopted for the modification of surfaces, but the chemical functionalization has attracted more and more attention over the last decades, since it can drive and regulate the first interfacial interaction between the material and the cells. In this context, novel thiol-enriched surfaces have been developed by using the well-known sol-gel chemistry (Chapter 2), to investigate the possibility to immobilize cells exclusively by disulphide bond formation between the exofacial protein thiols (EPTs) and thiols immobilized onto the surfaces. Two different alkoxides, tetraethyl orthosilicate (TEOS) and n-propyl trimethoxysilane (CH3), each with a variable amount of (3-mercaptopropyl)trimethoxysilane (MSH), have been used for the synthesis of sols that have been deposited onto glass surfaces by means of dip-coating process. A physico-chemical characterization was carried out, followed by the preliminary biological validation. The resulting surfaces showed variable wettability, roughness and coating thickness according to their chemistry and thiol content, that depended on the recipe of the starting solutions. Moreover, the surfaces have been tested as platforms for the selective thiol-mediated cell adhesion, by using HeLa cell line. We observed that the higher was the thiol content onto the surfaces, the higher was the number of cells retained. This result ascertained that EPTs actively participated in cell adhesion and they bound cells to thiol-presenting surfaces by means of disulphide bond formation. Based on these preliminary but appealing results, thiols were explored more in-depth as regulators of cell behaviour and functions (Chapter 3). Sol-gel spin-coating was used for the synthesis of thin and homogeneous coatings. We focused on the study of thiols role in mediating the cell response to the material by using MC3T3-E1 pre-osteoblasts. Thiol-functionalized surfaces turned out to affect cell adhesion, cytoskeleton organization, focal adhesions (FAs) formation and cell differentiation. Summarizing, we demonstrated that thiols activated the Rho GTPases pathways which are responsible for cytoskeleton and FAs assembly, as well as for lamellipodia and filopodia formation. By increasing the thiol content onto the surfaces, such effects raised, confirming that thiols were fundamental players in cell adhesion mechanisms. Finally, TEOS-based surfaces demonstrated to affect cell differentiation, by promoting osteogenesis, while a very light effect was observed for CH3-based surfaces. The grail of gene delivery is the development of safe and effective gene delivery vectors, and, in this scenario, there is the urgent need for the assessment of transfection efficiency and cytotoxicity in a fast and reliable manner. In this scenario, an easy-to-use microfluidic platform for the quantitative assessment of cell trapping, culture and transfection, and for the high-throughput screening of gene delivery vectors, has been validated and characterized. The device was endowed with a serial dilution generator (SDG) for the generation of a linear dilution of gene delivery particles and a downstream culture area for the trapping and culture of small groups of cells. The device allowed trapping roughly 10 cells per chamber and displayed enough room for exponential cell growth during the whole culture period. Moreover, the platform proved to be a reliable, very useful tool for the high-throughput analysis of transfection in a miniaturized fashion. The developed device allowed the screening and the optimization of the performances of gene delivery vectors through the selection of the best transfection conditions among five different transfectants doses generated simultaneously by the SDG. Overall, we present: i) the validation of thiol-functionalized surfaces as platforms for selective cell adhesion and the control of cell behaviour and differentiation; ii) the validation and characterization of a microfluidic device for cell culture and the screening of transfectants performances. These issues are aimed at designing a future device where thiol-functionalized surfaces are adopted as substrates of the microfluidic platform, in order to combine the fine control of cell adhesion and behaviour, with gene delivery studies.

Le cellule sono esposte a una vasta moltitudine di stimoli che determinano il loro comportamento e destino. Il controllo del comportamento e del destino cellulare in vitro è possibile attraverso lo sviluppo di biomateriali o strumenti, capaci di sostenere e regolare l’adesione, la proliferazione e il differenziamento cellulare. Oggigiorno, la scienza ha il fine di riprodurre il complesso scenario del microambiente cellulare, per studiare il comportamento e il destino delle cellule. L’obiettivo di questo lavoro di tesi è lo sviluppo di strategie innovative per il controllo del comportamento e del destino cellulare: i) la chimica sol-gel è stata applicata per la funzionalizzazione di vetrini con coatings a contenuto variabile di tioli, con l’obiettivo di studiare tali gruppi chimici come mediatori dell’adesione e di specifiche funzioni cellulari; ii) un dispositivo di microfluidica è stato validato per l’intrappolamento, la coltura e la trasfezione non virale di piccoli gruppi di cellule, e per un rapido screening delle performances di trasfettanti commerciali. Diverse strategie sono state impiegate in letteratura per realizzare modifiche di superficie, e tra queste, la funzionalizzazione chimica ha guadagnato un vasto consenso negli ultimi decenni, poiché permette di guidare e regolare in modo molto fine e versatile l’interazione cellula-materiale. In tale contesto, sono state sviluppate superfici innovative a base di tioli attraverso la chimica sol-gel (Capitolo 2); l’immobilizzazione delle cellule avviene a seguito della generazione di un ponte disolfuro tra i tioli di superficie e quelli esposti sulla membrana cellulare (Exofacial Protein Thiols, EPTs). Due differenti alcossidi precursori, tetraetil-ortosilicato (TEOS) e n-propil trimetossisilano (CH3), a ognuno dei quali è stato aggiunto un contenuto variabile di (3-mercaptopropil) trimetossisilano (MSH), sono stati impiegati per la sintesi di sols, depositati successivamente su vetrini attraverso tecnica dip-coating. È stata in seguito svolta una caratterizzazione chimico-fisica dei coatings realizzati e una preliminare validazione biologica. Le superfici hanno mostrato una bagnabilità, rugosità e spessore del coating variabili e dipendenti dalla chimica di superficie e dal contenuto di tioli. Inoltre, le superfici sono state testate come piattaforme per l’adesione selettiva mediata da tioli, utilizzando cellule di linea HeLa. È stato osservato che, all’aumentare del contenuto di tioli in superficie, aumentava il numero di cellule immobilizzate. È quindi emerso che i tioli cellulari partecipano attivamente nell’adesione cellulare e legano i tioli immobilizzati sulle superfici attraverso la generazione di un ponte disolfuro. Basandosi su tali risultati preliminari estremamente promettenti, i tioli sono stati studiati in modo più approfondito come mediatori del comportamento e delle funzioni cellulari (Capitolo 3). La tecnica sol-gel, seguita da deposizione tramite spin-coating, è stata applicata per la sintesi e la deposizione di coatings molto sottili ed omogenei. Ci siamo focalizzati sullo studio del ruolo dei tioli nella risposta cellulare su superfici tiolate, usando pre-osteoblasti MC3T3-E1. Le superfici funzionalizzate con tioli hanno determinato l’organizzazione del citoscheletro, delle adesioni focali, e del differenziamento, in cellule deprivate dal siero. Abbiamo dimostrato che i tioli attivano i meccanismi delle proteine Rho GTPasi, che sono responsabili dell’organizzazione del citoscheletro e della formazione delle adesioni focali, dei lamellipodia e filopodia. All’aumentare del contenuto di tioli in superficie, tale effetto cresceva, confermando quindi che i tioli partecipano attivamente nell’adesione cellulare. Superfici a base TEOS hanno in particolare favorito il differenziamento, promuovendo l’osteogenesi. La tesi si è inoltre focalizzata sullo sviluppo e la validazione di un dispositivo di microfluidica, per l’intrappolamento, la coltura e la trasfezione di cellule. Il dispositivo ha permesso lo screening di comuni trasfettanti, in modo rapido e affidabile. Nel dispositivo sono state implementate due porzioni: il generatore di gradiente (SDG) per la diluizione lineare di vettori per gene delivery, e una porzione sottostante per la coltura cellulare di piccoli gruppi di cellule. Il dispositivo permette di intrappolare una decina di cellule per camera e fornisce sufficiente spazio per la loro crescita. Il dispositivo permette lo screening e l’ottimizzazione delle performances di vettori per gene delivery, e la selezione delle migliori condizioni di trasfezione tra le 5 dosi di trasfettante generate dal gradiente. In futuro, le superfici tiolate verranno adottate come substrati per la piattaforma microfluidica, così da integrare il controllo dell’adesione e del comportamento cellulare mediati da tioli, con strategie di gene delivery.