Multiview reconstruction in a bright field optical microscope

Sight has always been one of the most important channels for approaching nature. Since the ancient times, different new tools for improving this sense and its ability to observe small objects were built: starting from simple optical apparatus, different instruments were developed to overcome naked eye limits, till reaching one of the main instruments of optics, the microscope. In the field of optical microscopy based on visible light, several different techniques have been developed during the last two centuries. Among these the three types of microscopy that are mostly widely used are bright-field, phase-contrast and fluorescence microscopy. A bright-field microscope consists in a light source that illuminates the sample (typically with controllable illumination numerical aperture) and a detection stage that collects the light transmitted through a sample, to create a magnified image of the illuminated sample. Light microscopy became a common tool for several disciplines including material sciences, biology and life science. In particular, in the context of life science, a constant challenge is to observe cellular behavior in a live tissue. For this reason in the last decades a great effort has been dedicated to the development of three dimensional microscopy of living samples. This field wants to retrieve information about genes behavior, dynamic processes and organs structures, and eventually fuse them together for deeper understanding of biophysics and biological phenomena. Around this topic, many different techniques were developed and continuously improved to increase resolution, imaging penetration depth and whole specimens imaging. The most used technology for 3D imaging is confocal microscopy, which, based on pointwise illumination and out-of-focus light filtering at detection, recovers the sample in 3D with diffraction limited resolution. Due to this signal filtering at detection, a huge amount of light is lost, such that at illumination step a lot of light is sent on the sample, giving photo-damaging of the sample. An alternative 3D technique is Optical Coherent Tomography (OCT), which provides high resolution and contrast, but is not well suited to study a tissue at cellular-level resolution. Optical Projection Tomography (OPT) was shown as an alternative imaging technique that allows scientists to reach cellular-level resolution and scan over large tissue volumes (almost one cube centimeter of sample coverage in chemically cleared biological samples). OPT configuration is close to Computed Tomography one: X-rays impinges on a sample which absorbs them; then, transmitted light is detected. The sample structure can be retrieved through the behavior of different areas characterized by different biological tissues, due to a varying absorption coefficient. Therefore, OPT can work both in fluorescence (emission) and transmission regimes. The light path is the same of Computed Tomography while the sample is imaged from different points of view, to investigate different regions of the specimen. OPT presents several advantages compared to other imaging techniques (first of all it requires a very simple and low cost setup) but, on the other hand, it is affected by two major problems: artefacts due to the diffraction of light in the OPT setup; need for the acquisition of the sample at several (thousands) views. In this thesis work, I developed a 3D Multiview Reconstruction method that, similarly to OPT, reconstructs a 3D image of the sample. The method solves the problems of the artifacts, taking into account the diffraction of the sample, and reduces the number of acquired views by an order of magnitude.

La vista è sempre stata uno dei canali più importanti per avvicinarsi alla natura. Sin dai tempi antichi, sono stati costruiti diversi nuovi strumenti per migliorare questo senso e la sua capacità di osservare piccoli oggetti: partendo da semplici apparecchi ottici, sono stati sviluppati strumenti diversi per superare i limiti dell'occhio nudo, fino a raggiungere uno dei principali strumenti ottici, il microscopio. Nel campo della microscopia ottica basata sulla luce visibile, diverse tecniche sono state sviluppate negli ultimi due secoli. Tra questi i tre tipi di microscopia maggiormente utilizzati sono bright field, phase-contrast e fluorescence microscopy. Un microscopio bright field consiste in una sorgente luminosa che illumina il campione (in genere con un'apertura numerica di illuminazione controllabile) e un componente di rilevamento che raccoglie la luce trasmessa attraverso il campione, per creare un'immagine ingrandita del campione illuminato. La microscopia ottica divenne uno strumento comune per diverse discipline tra cui le scienze dei materiali, la biologia e le scienze della vita. In particolare, nel contesto delle scienze della vita, una sfida costante è osservare il comportamento cellulare in un tessuto vivo. Per questo motivo negli ultimi decenni è stato dedicato un grande sforzo allo sviluppo della microscopia tridimensionale di campioni viventi. Questo campo vuole recuperare informazioni sul comportamento dei geni, dei processi dinamici e delle strutture degli organi, e alla fine fonderli insieme per una più profonda comprensione della biofisica e dei fenomeni biologici. In questo ambito sono state sviluppate e continuamente migliorate molte tecniche diverse per aumentare la risoluzione, la profondità di penetrazione delle immagini e l'imaging di campioni interi. La tecnologia più utilizzata per l'imaging 3D è la microscopia confocale, che, basata sull'illuminazione puntuale e sul filtraggio della luce fuori fuoco allo step di rilevamento, recupera la struttura del campione in 3D con una risoluzione limitata dalla diffrazione. A causa di questo filtraggio del segnale al momento del rilevamento, viene persa un'enorme quantità di luce, cosicché alla fase di illuminazione viene inviata molta luce sul campione, causando un danneggiamento del campione. Una tecnica 3D alternativa è la Optical Coherent Tomography (OCT) che fornisce alti risoluzione e contrasto, ma non è adatto per lo studio di un tessuto a risoluzione cellulare. Optical Projection Tomography (OPT) è stata presentata come una tecnica di imaging alternativa che consente agli scienziati di raggiungere una risoluzione a livello cellulare e di eseguire la scansione su grandi volumi di tessuto (quasi un centimetro cubo della copertura del campione in campioni biologici purificati chimicamente). La configurazione dell'OPT è simile a quella della Computed Tomography: i raggi X colpiscono un campione che li assorbe; quindi, viene rilevata la luce trasmessa. La struttura del campione può essere recuperata attraverso il comportamento di diverse aree caratterizzate da diversi tessuti biologici. Pertanto, OPT può funzionare sia in regime di fluorescenza (emissione)che in regime di trasmissione. Il percorso della luce è lo stesso della Computed Tomography, ma il campione è osservato da diversi punti di vista, per indagare diverse regioni del campione. OPT presenta diversi vantaggi rispetto ad altre tecniche di imaging (prima di tutto richiede una configurazione molto semplice e di basso costo) ma, d'altra parte, è affetta da due problemi principali: vi sono degli artefatti dovuti alla diffrazione della luce nel setup di OPT; vi è la necessità di acquisire il campione da diverse (migliaia) angolazioni. In questo lavoro di tesi, ho sviluppato un metodo di ricostruzione 3D multiview che, analogamente all'OPT, ricostruisce un'immagine 3D del campione. Il metodo risolve i problemi degli artefatti, tenendo conto della diffrazione del campione, e riduce il numero di viste acquisite di un ordine di grandezza.