Optimization of a perfusion process for the production of monoclonal antibodies

Monoclonal antibodies (mAbs) are therapeutic proteins used for the treatment of a variety of life-threatening diseases including autoimmune conditions, cardiovascular and infectious diseases, inflammation and cancer. They can be designed and customized in terms of potency, dosing frequency and specificity for their target antigen offering huge benefits over conventional pharmacotherapy. For this reasons, many biopharmaceutical and biotechnology companies are focusing on the production of biological drugs and the global antibody production market size, valued at USD 7.4 billion in 2016, is projected to grow at 13.5% over the period 2018-2025. The cost pressure and the market competition, together with the necessity of high-quality, reliable and flexible production processes pushes the manufacturers toward the implementation of cultivation modes which guarantee concrete competitive advantages. Among the process modes commonly used in biomanufacturing, the continuous perfusion bioreactors are certainly an appealing alternative. The great advantage over the other methods is that the cells are retained in the culture and remain in a steady environment since fresh medium is continuously supplied, the by-products are continuously removed and the therapeutic product is continuously harvested. This feature, combined with the use of cell retention devices, determines that the culture can be performed at viable cell densities as high as 100 × 106 cells/mL, in a large timeframe with steady-state operations. As a result, higher productivities and improved quality are obtained. The present work aimed at optimising a continuous perfusion process for the cultivation of a mAb producing Chinese hamster ovary (CHO) cell line. After observing the long-term behaviour of the culture using a proprietary standard chemically defined medium, a spin-tube bioreactor model was used to screen two modified formulations. The most promising composition was then transferred to the 2L perfused bioreactor, to evaluate the effect of the increased osmolarity and to supply possible limiting nutrients to the cells. The optimized process resulted overall more stable over a long period, showing better trends in terms of titer and productivity. Moreover, the diameter shrinking and the increase of growth rate, observed in the standard process were not reported in the optimized process. On the other hand, the mechanism that lies beyond the increased lactate production and decreased productivity reported at the end of both the runs has still to be clarified. Alternatively, we proposed an optimization based on the reduction of the temperature from 36.5°C to 33.0°C. The results, in this case, showed good productivity and decreased growth rate confirming what is found in the literature. However, a proper comparison with the standard baseline process was not possible since the cell culture declined. The analysis of the measurements suggests that probably the temperature shift was too strong and the cells started dying. Eventually, the time profiles of the perfusion processes were observed together with the results obtained from a traditional fed-batch process. The comparison between the two cultivation modes showed higher attainable viable cell densities and longer duration of the operation in the case of perfusion, resulting in a 4.5-fold improvement of the volumetric productivity. In conclusion, the defined process represents an improvement of the previous standard and with respect to the traditional fed-batch mode. However, additional studies are needed to overcome the observed metabolic changes, to stabilise the culture over a longer time-frame, to further increase productivity and consequently reduce the costs.

Gli anticorpi monoclonali sono proteine naturalmente presenti nel corpo umano. Data la loro flessibilità in termini di efficacia, specificità per l’antigene d’interesse e frequenza di somministrazione offrono grandi vantaggi rispetto alle terapie farmacologiche convenzionali e sono attualmente utilizzati per la cura di una grande varietà di patologie invalidanti, quali malattie autoimmuni, cardiovascolari e infettive e per il trattamento di stati infiammatori acuti e di tumori. Molte industrie farmaceutiche stanno incentrando la loro attività di ricerca e sviluppo in questo ambito, contribuendo alla crescita del mercato delle terapie biologiche. Per il mercato globale degli anticorpi monoclonali, valutato 7.4 miliardi di US $ nel 2016, si stima una crescita del 13.5% nel periodo 2018-2025. La competizione economica si affianca dalla necessità di processi robusti, qualitativamente certificati e flessibili e spinge le industrie ad implementare metodi di produzione che garantiscano un effettivo vantaggio economico. Tra i processi tradizionalmente utilizzati nella produzione industriale, i metodi continui rappresentano una valida alternativa già diffusa in molti settori. Nell’ambito farmaceutico, questa modalità è rappresentata dai bioreattori in perfusione che, rispetto ad altri metodi, garantiscono che le cellule siano coltivate in un ambiente stabile in cui il nutrimento viene fornito continuamente, i prodotti di scarto vengono eliminati e la molecola prodotta viene contemporaneamente raccolta. Queste condizioni, combinate con dispositivi che consentono di trattenere le cellule nel bioreattore, consentono il raggiungimento di elevatissime densità (fino a 100 × 106 cellule/mL) ed il loro mantenimento per lunghi periodi di tempo, favorendo l’aumento della produttività e il miglioramento della qualità del prodotto. Lo studio presentato ha riguardato l’ottimizzazione di una coltura continua operata in perfusione per la produzione di un anticorpo monoclonale espresso da un clone di cellule CHO (Chinese hamster ovary). Dopo aver valutato il comportamento delle cellule coltivate in un medium industrialmente predefinito, sono state messe a punto due formulazioni arricchite a partire dal medium standard, utilizzando degli spin-tube da 50 mL come modello per lo screening. La composizione più promettente è stata successivamente validata in un bioreattore con un volume di lavoro di 1.5 L, con il duplice obiettivo di valutare l’effetto dell’aumentata osmolarità e dell’aggiunta di macronutrienti diversi dal glucosio sulle prestazioni della coltura. Nel bioreattore perfuso con il medium ottimizzato il processo è risultato complessivamente più stabile nel tempo sia in termini di titolo che di produttività specifica. Inoltre non si sono presentati né la riduzione del diametro cellulare né l’alterazione del tasso di crescita che erano stati evidenziati nel processo di base. Tuttavia, rimangono ancora poco chiari l’aumentata produzione di lattato e il declino di produttività osservati in entrambi i processi alla fine degli esperimenti. In alternativa, è stato valutato il comportamento delle cellule sottoposte ad uno stress ambientale rappresentato da un salto di temperatura da 36.5°C a 33.0°C. I risultati hanno effettivamente confermato l’aumento di produttività e il contenimento della crescita riportati in letteratura. Tuttavia il declino della coltura in un lasso temporale piuttosto contenuto suggerisce che la temperatura scelta sia stata troppo bassa. Le performance della coltura in perfusione sono state poi confrontate con quelle osservate in un processo eseguito con modalità fed-batch, con la stessa linea cellulare e con il medium base. I risultati hanno mostrato che la perfusione consente di ottenere valori di densità cellulari più elevati e per un periodo di tempo più esteso, determinando un valore di produttività volumetrica fino a 4.5 volte maggiore rispetto al fed-batch. In conclusione, il processo sviluppato in questo studio ha comportato un miglioramento rispetto allo standard. Tuttavia, esperimenti aggiuntivi per comprendere e superare le alterazioni metaboliche osservate, potrebbero essere utili per stabilizzare la linea cellulare in una finestra temporale più estesa, per aumentare ulteriormente la produttività e per ridurre di conseguenza i costi del processo.