Development of a biomimetic electrospun construct as an in vitro 3D skeletal tissue model

The final purpose of this thesis is to design and produce a 3D construct that will deliver stem cell in situ and control their function for bone and cartilage defects. The scaffold is designed by taking inspiration from MSC cell niche environment present in the bone marrow and by recapitulating it into macroscopic clinically relevant electrospun constructs. The system is engineered to act as cell depot that replenishes the targeted bone and cartilage tissues maintaining homeostasis and promoting hMSC migration and proliferation over time. Some key aspects were examined: (I) the optimization of the electrospinning process parameters to obtain suitable porosity and fiber diameter; (II) the migration hMSC through electrospun scaffolds; (III) the effect of different functionalization on hMSCs proliferation; (IV) the creation of chemical and physical gradients to guide cell migration; (V) the combination of different materials to obtain a 3D construct as a hMSCs delivery system. Therefore, many PolyActive® matrices were spun and the diameter and morphology of their fibers were measured using a SEM. Co-electrospinning with sacrificial polymer (PEO-PEG) was performed to enhance scaffold porosity. Subsequently, the hMSCs were seeded on electrospun matrices and the cell migration evaluated counted the stained nuclei on the upper and lower surfaces of the scaffolds by fluorescence microscopy. The proliferation of hMSC was evaluated in the presence or absence of growth factors (FGF-2) coupled to the surface scaffold using a direct method (EDC-NHS) and an indirect method (Heparin). To further understand the effect of these biological signals, a comparative study on functionalized PolyActive films was conducted. Chemical and mechanical in-depth gradients have been created by controlling the FLUIDNA TEK® electrospinning machine through customize programs in LabVIEW. All these experiments were performed with the aim of preparing a final study to evaluate cell migration in a hybrid construct as hMSCs delivery system, combining alginate hydrogel and electrospun mesh in 2D and 3D. The combined construct will be evaluated in preliminary in vivo experiments as subcutaneous implants in immune-deficit mice for 3-6 weeks.

Il questo progetto di tesi mira a produrre costrutti ingegnerizzati elettrofilati in cui gli scaffold funzionino come sistemi di rilascio di cellule staminali che controllino attivamente migrazione e proliferazione cellulare. Questa sfida verrà affrontata attraverso un design biomimetico ispirato alla nicchia delle cellule staminali mesenchimali. Sono perciò stati esaminati alcuni aspetti fondamentali quali: (I) l'ottimizzazione del processo di elettrofilatura per ottenere porosità e diametri delle fibre differenti; (II) la migrazione delle cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) attraverso scaffold elettrofilati; (III) l'effetto della funzionalizzazione con fattori di crescita sulla proliferazione di hMSCs; (IV) la realizzazione di gradienti chimici e fisici per guidare la migrazione cellulare; (V) la combinazione di diversi materiali per ottenere un costrutto 3D come sistema di consegna di hMSCs. Pertanto, sono state elettrofilate e caratterizzate differenti matrici caratterizzate da differenti diametri di fibra (~1-3 µm) ed area dei pori (~10-40 µm2). Successivamente, le hMSC sono state seminate sugli scaffold elettrofilati e la migrazione cellulare valutata attraverso la conta dei nuclei colorati sulla superficie superiore e inferiore degli scaffold mediante microscopia a fluorescenza a 1, 4, 7 giorni di coltura. Le cellule sono migrate con successo attraverso matrici elettrofilate di spessore ~80 µm in condizioni di coltura standard. Una infiltrazione maggiore (~110 µm) è stata osservata per matrici caratterizzate dal medesimo diametro di fibra (Ф = 3 µm) ma area dei pori aumentata grazie ad una co-elettrofilatura con polimero sacrificabile (da 20 a 40 µm2). Spessori maggiori sono stati infiltrati coltivando i costrutti elettrofilati in transwell e creando, attraverso la membrana, un gradiente di FBS. La proliferazione cellulare è stata valutata in presenza o assenza di fattori di crescita (FGF-2) legati alle fibre attraverso metodo diretto e indiretto. Contrariamente alle aspettative, le cellule non hanno risposto positivamente agli stimoli di crescita e nessuna differenza significativa è stata osservata tra le differenti condizioni di coltura, in assenza e presenza di FGF-2 covalentemente o a-specificatamente legati alla superficie. Per comprendere ulteriormente l'effetto di questi segnali biologici, è stato condotto uno studio comparativo su film di PolyActive funzionalizzati. FGF-2 disciolti nel mezzo di coltura hanno incentivato la proliferazione per hMSC coltivate in pozzetti, ma non per cellule coltivate su substrati in PolyActive (film o matrici elettrofilate). Particolare attenzione è stata posta nel guidare il comportamento delle cellule, creando gradienti adatti a dirigere la motilità cellulare attraverso lo spessore della matrice elettrofilata. Sono stati con successo realizzati gradienti chimici (gruppi alchini) e strutturali (diametro di fibra crescente 1-3 µm) omogeni attraverso la sezione dello scaffold, Questi esperimenti sono stati eseguiti con l'obiettivo di preparare le basi per uno studio sulla migrazione cellulare in un costrutto modulare, combinando idrogelo e scaffold elettrofilato in 2D e 3D. Infatti, è stato necessario comprendere: (I) l'effetto dei parametri di elettrofilatura sul diametro e sulla porosità delle fibre; (II) le condizioni più idonee per consentire e migliorare la migrazione e la proliferazione cellulare attraverso la maglia elettrofilata, prendendo in considerazione l'effetto di diversi fattori biologici; III) un modo di condurre il comportamento delle cellule in una direzione specifica attraverso gradienti di profondità. La realizzazione di una coppa 3D elettrofilata ed uno studio preliminare su un costrutto congiunto di idrogelo e coppa, ha evidenziato la capacita cellulare di migrare attraverso differenti substrati. Le cellule sono migrate dall’idrogelo, in cui sono state seminate, alle fibre elettrofilate e, successivamente, attraverso lo spessore della coppa elettrofilata (~50 µm), passando da un ambiente interno isolato a poter comunicare con l’ambiente esterno. Questo costrutto si presenta perciò come un prototipo di sistema di trasporto impiantabile per cellule staminali alloggiate in idrogelo.