Design and development of an automated system for lab-on-chip programming and testing in high volume manufacturing

In recent years, Point-of-Care Testing (POCT) is spreading as a new trend in medical diagnostic. It consists of performing medical analysis near the patient's care and assistance site. The driving concept is to allow the execution of the tests in the simplest, most convenient and immediate way possible. So that it is not necessary to send the samples in some distant laboratory to obtain an analysis and wait several days for a response. Within this trend Lab-on-Chip (LoC) devices have the goal of integrating all the steps necessary for an analysis, normally performed on different machines in a laboratory, in a single chip. This device needs to have reduced dimensions and low costs for each analysis. One of the most common analysis techniques in molecular biology laboratories is the Polymerase Chain Reaction (PCR). Since its invention in 1983 it has spread and established as a fundamental technique in many areas. It allows to amplify quickly and in vitro a certain DNA sequence contained in an initial sample, obtaining at the end of the process a higher concentration of the specific sequence. The amplification is performed in presence of certain reagents and thanks to a thermal cycling, the fundamental element for the success of the technique. The evolution of PCR is the Real-Time PCR, in which the process of amplification is observed in real time thanks to the use of fluorescence marking techniques and an optical detector. By measuring the fluorescence intensity at the end of each thermal cycle it is possible to obtain the amount of amplified DNA. These data allow quantitative evaluations on the sample which are not possible with a traditional PCR. In the last few years, numerous prototypes of devices, able to perform a Real-Time PCR analysis without the use of complex, expensive and bulky thermocyclers, have been developed. Among these the devices based on Lab-on-Chip are very promising. Some years ago, semiconductor manufacturer STMicroelectronics started developing one of these devices, compact and portable. The latest version is represented by the Q3-Plus device, which is part of a system, composed of three elements, to perform Real-Time PCR analysis in a simple and fast way, even by some non-trained personnel. The three elements are the device, a PC software for checking the analysis and a disposable cartridge. The cartridge uses Lab-on-Chip technology and forms the central element of the system, within which the PCR reaction takes place. The system is designed to be used in various areas and through specific agreements with partner companies, numerous specific applications are developed. In fact, the cartridge needs to be completed by the necessary reagents before being shipped to the final used. The applications of that kind of device can range in different work areas: from the diagnosis of bacterial infections (an example is the test for Tuberculosis) or viral infections (HIV, Hepatitis B, Ebola) to the study of gene expressions. These applications can range in other sectors besides the medicine, such as dentistry or the agri-food sector. There are therefore numerous partners and retailers and this situation can potentially create a competitive market on the same device. In these last period, after a first phase of study and planning, STMicroelectronics is launching the commercialization of the system, significantly increasing the volume of cartridges produced. Therefore, scalability problems are introduced in the cartridges testing, which is currently and temporarily performed individually by an operator. This thesis work intends to solve three problems that have been identified: • The need for a security system to prevent the commercialization and the use of counterfeit non-original chips, and to prevent competition between retailers operating in different geographical areas or fields of analysis. • The need for a cartridge tracing system that can track the manufacturing process and the reagents insertion, in order to be able to trace any errors in the production process. • The need for a new final test device that performs the electrical test on cartridges at the end of the production phase. This device should improve the speed to perform the test in order to fit with the new production volumes. The present thesis work is divided into five main chapters: • Chapter 1: the POCT devices are described in their most known implementations: PaperBased diagnostic tools and Lab-on-Chip devices. The PCR and Real-Time PCR techniques are then presented as well their implementation in different LoC devices. • Chapter 2: this section presents the Real-Time PCR system designed by STMicroelectronics. Its two main parts are described: the Q3-Plus device and the cartridge. The system of actors that operate in the various phases of production of the cartridge, design and insertion of the reagents and subsequent commercialization is then analyzed. • Chapter 3: this chapter is dedicated to the developed security and traceability system. The system is presented divided into four parts. Particular attention is given to the technical choices regarding the cryptographic algorithms used. • Chapter 4: the new device dedicated to the final test of cartridges is described here. Following in the chapter are presented the stages of development and implementation of the same, analyzing the hardware, the firmware and the software that compose it. • Chapter 5: after the realization of the new device, its use has been characterized. Some tests have been executed in order to make comparisons with the previous device in term of time of testing and programming. It is further presented a comparison on the electrical measures with a high precision multimeter. In conclusion some final considerations regarding the realized work are presented, together with some possible future developments.

Negli ultimi anni si ricorre sempre più spesso al Point-of-Care Testing (POCT), ovvero lo svolgimento di analisi mediche e assistenza al paziente in prossimità del sito di cura. L’obiettivo è quello di permettere l’esecuzione dei test nel modo più semplice, comodo ed immediato possibile, così che non sia necessario inviare i campioni in distanti laboratori di analisi ed attendere giorni per un referto. All’interno di questo quadro si collocano i dispositivi Lab-on-Chip (LoC) che si prefiggono l’obiettivo di integrare tutte le fasi necessarie ad un’analisi, normalmente svolte su macchinari diversi in un laboratorio, in un unico chip. Questo dispositivo è solitamente caratterizzato da dimensioni ridotte e bassi costi per ogni singola analisi. Una delle tecniche di analisi più presenti nei laboratori di biologia molecolare è sicuramente la reazione a catena della polimerasi (PCR). Sin dalla sua ideazione nel 1983 questa si è diffusa ed affermata come tecnica fondamentale in un elevato numero di ambiti. Essa permette di amplificare rapidamente in vitro una certa sequenza di DNA contenuta in un campione iniziale, ottenendone una quantità molto superiore al termine del processo. L’amplificazione avviene grazie alla presenza di determinati reagenti e ad una ciclatura termica, elemento fondamentale per una buona riuscita della tecnica. Evoluzione della PCR è la Real-Time PCR, in cui il processo viene osservato in tempo reale grazie all’utilizzo di tecniche di marcatura in fluorescenza e ad un rilevatore ottico. Misurando l’intensità di fluorescenza al termine di ogni ciclo termico è possibile ricavare la quantità di DNA effettivamente amplificato. Questi dati permettono delle valutazioni di tipo quantitativo sul campione che con una PCR tradizionale non sono possibili. Nel corso degli ultimi anni sono stati sviluppati numerosi prototipi di dispositivi capaci di effettuare una analisi Real-Time PCR senza l’utilizzo di complessi, costosi e voluminosi termociclatori, tra questi molto promettenti sono appunto i dispositivi basati su Lab-on-Chip. Da alcuni anni l’azienda di semiconduttori STMicroelectronics sta sviluppando uno di questi dispositivi, compatto e portatile. L’ultima versione di tale dispositivo è rappresentata dal Q3-Plus, che fa parte di un sistema composto da tre elementi per eseguire analisi di Real-Time PCR in modo semplice e veloce, anche da parte di personale non qualificato. I tre elementi sono il già citato dispositivo, un software PC per controllare l’analisi ed una cartuccia usa e getta. La cartuccia utilizza la tecnologia di Lab-on-Chip e costituisce l’elemento centrale del sistema, all’interno della quale la reazione di PCR avviene. Il sistema è pensato per poter essere utilizzato in vari ambiti e tramite accordi con aziende partner vengono sviluppate numerose applicazioni specifiche. La cartuccia infatti necessita di essere completata dai reagenti necessari prima di essere venduta al cliente finale. Le applicazioni possibili sono svariate: dalla diagnosi di infezioni batteriche (un esempio è il test per la Tubercolosi) o virali (HIV, Epatite B, Ebola) allo studio di espressioni geniche. Queste applicazioni oltre alla medicina possono spaziare in altri settori, come in odontoiatria o nel settore agroalimentare. Sono presenti quindi numerosi partner e rivenditori che possono potenzialmente creare una situazione di concorrenza sullo stesso dispositivo. In questi ultimi periodi dopo una prima fase di studio e progettazione STMicroelectronics sta avviando la commercializzazione del sistema, incrementando notevolmente i volumi di cartucce prodotte. Si introducono quindi problemi di scalabilità per quanto riguarda il test delle cartucce, che attualmente e temporaneamente è effettuato singolarmente da un operatore. Più in dettaglio, sono state identificate 3 problematiche che questo progetto di tesi ha intenzione di risolvere: • Necessità di un sistema di sicurezza che impedisca la commercializzazione e l’utilizzo di chip contraffatti e che impedisca la concorrenza tra rivenditori operanti in zone geografiche o campi di analisi differenti. • Necessità di un sistema di riconoscimento delle cartucce che possa tenere traccia del processo di fabbricazione e dei reagenti contenuti, in modo da poter risalire ad eventuali errori del processo produttivo. • Necessità di un nuovo dispositivo che permetta la scalabilità del test delle cartucce, successivo alla fase di produzione. Il presente lavoro di tesi è articolato in cinque capitoli principali: • Capitolo 1: vengono qui descritti i dispositivi POCT nelle loro più conosciute implementazioni: test diagnostici su carta e dispositivi Lab-on-Chip. Sono poi presentate le tecniche di PCR e Real-Time PCR e la loro implementazione in diversi dispositivi LoC a titolo di esempio. • Capitolo 2: in questa sezione viene descritto il sistema per Real-Time PCR progettato da STMicroelectronics. Di esso vengono analizzati il dispositivo Q3-Plus, la cartuccia ed il sistema di attori che intervengono nelle varie fasi di realizzazione della cartuccia, dalla sua produzione alla progettazione ed inserimento dei reagenti, alla successiva commercializzazione. • Capitolo 3: questo capitolo è dedicato al sistema di sicurezza e tracciabilità sviluppato. Viene presentato il sistema suddiviso in quattro parti e posta attenzione alle scelte tecniche riguardanti gli algoritmi di crittografia utilizzati. • Capitolo 4: viene qui descritto il nuovo dispositivo dedicato al test delle cartucce. Di seguito all’interno del capitolo sono presentate le fasi di sviluppo e realizzazione dello stesso, analizzando l’hardware, il firmware ed il software che lo compongono. • Capitolo 5: a seguito della realizzazione del nuovo dispositivo, è stato possibile effettuare alcuni confronti sui tempi impiegati per il test di interi lotti di cartu cce, come pure il confronto delle misurazioni con un multimetro ad alta precisione. In conclusione, sono presenti alcune considerazioni finali sul lavoro svolto e su possibili sviluppi futuri.