Development of fluorinated liposomes for 19F-MRI and gene delivery

In the field of nanomedicine, a novel discipline called theranostics investigates multifunctional nanoplatforms that allow simultaneous delivery of targeting, therapeutic and imaging agents. In the meanwhile, growing interest concerns gene expression regulation as innovative therapy and 19F-MRI as complementary diagnostic technique to 1H-MRI. In this context, the aim of this research work is focused on the development of a nanotheranostic carrier able to both deliver miRNA and be trackable by 19F-MRI. To this purpose, liposomes are particularly indicated since they are spherical vesicles consisting of an aqueous core surrounded by a phospholipid bilayer, thus able to encapsulate hydrophobic molecules in the membrane. Moreover, cationic liposomes are commonly employed in gene delivery thanks to their electrostatic interaction with oligonucleotides. Being cationic lipids more toxic than zwitterionic, a mixture of them is usually employed for the preparation of positively charged liposomes. Herein, innovative formulations of first neutral and then cationic liposomes carrying a superfluorinated contrast agent are described. The vesicles were mainly prepared by hydrating a previously dried lipid film. Subsequent treatments of size reduction and dispersion homogenization were performed by either tip sonication or extrusion followed by dialysis. Characterization was accomplished by Dynamic Light Scattering, 19F-Nuclear Magnetic Resonance and Zeta Potential. Firstly, three different attempts of preparing labelled liposomes from a natural phospholipid (Lecithin) were performed. The results were unsatisfying in terms of encapsulation, size distribution and stability. Thus, the focus moved to synthetic phospholipids. The composition, preparation and post-processing protocol were optimized for fluorinated neutral DOPC liposomes. Then, the cationic component (DOTAP) was added. Eventually, after further optimization, a protocol for the preparation of an almost homogeneous dispersion of cationic liposomes, small in size, with positive surface charge, a sufficient number of 19F atoms and excellent magnetic properties to be visible by 19F-MRI, was defined.

La teranostica è un ramo della nanomedicina che si occupa dello sviluppo di nanosistemi multivalenti che comprendono agenti di targeting, terapeutici e diagnostici. Al contempo, la regolazione dell’espressione genetica si sta affermando come trattamento terapeutico e la risonanza magnetica (RM) del nucleo 19F sta emergendo come tecnica diagnostica. Questo progetto di tesi mira a sviluppare un vettore nanoteranostico adatto al trasporto simultaneo di miRNA e di un agente di contrasto per 19F-RM. A tale scopo, i liposomi vengono impiegati come vettori poiché capaci di incapsulare molecole idrofobiche all’interno del loro bistrato fosfolipidico. Inoltre, i liposomi con carica superficiale positiva, derivanti da formulazioni miste di lipidi neutri e cationici in quanto quest’ultimi da soli si sono rivelati tossici, sono spesso utilizzati per il trasporto di materiale genetico grazie alla loro interazione elettrostatica con gli acidi nucleici. L’elaborato tratterà quindi lo sviluppo di liposomi contenenti un agente fluorurato, prima neutri e poi misti con carica superficiale positiva. I liposomi sono stati preparati principalmente per idratazione di un film lipidico. La riduzione delle dimensioni e della polidispersità è avvenuta tramite o sonicazione o estrusione seguita da dialisi. La caratterizzazione è stata eseguita grazie a Scattering Dinamico della luce, Risonanza Magnetica Nucleare e misure di Potenziale Zeta. All’inizio sono stati sperimentati tre diversi metodi di preparazione a partire da un fosfolipide naturale (Lecitina). Tuttavia, i risultati erano insoddisfacenti in termini di incapsulamento, dimensioni e instabilità. L’attenzione si è spostata sui lipidi sintetici, in particolare sulla DOPC. La composizione, il protocollo di preparazione e i trattamenti successivi sono stati ottimizzati, ottenendo promettenti liposomi neutri fluorurati. Si è proceduto quindi all’aggiunta della componente cationica (DOTAP). Una volta ottimizzato, il protocollo finale fornisce una dispersione quasi omogenea di liposomi cationici di dimensioni ridotte, con carica superficiale positiva, un numero sufficiente di atomi 19F e proprietà eccellenti per applicazioni 19F-RM.