Optical and microfluidic optimization for on-chip fluorescence imaging of Drosophila Embryos

In the last years, several techniques for biological inspection and sample analysis at the micro- or nano-scale have been proposed. In particular, fluorescence microscopy offers the exciting possibility of labelling only the interested specimens with suitable fluorophores, imaging them on an almost dark background. This approach has numerous advantages including high selectivity and multi-colour high-resolution imaging; as a result, it has been object of an always growing interest among the scientific community. Inheriting all the characteristics of fluorescence microscopy, SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy) can bring the quality of biological investigation to an even higher level. This technique allows to illuminate the sample with a focused light sheet, obtaining a plane-by-plane optical sectioning. As a consequence, photo-toxicity, photo-bleaching and photo-damage are strongly reduced but, most importantly, the acquired planes can be used to generate a complete 3D reconstruction of the specimen, where only the fluorescent marked constructs are visible. However, mounting and alignment procedures are time-consuming, limiting the use of SPIM for statistical measurements on large sample populations. Moreover, it requires bulk laboratory equipment which is incompatible with in loco analyses. A lab-on-chip approach to SPIM has been proposed to reduce sample mounting procedures and favouring an always good alignment between optical components, making it suitable for high throughput investigations. This integrated device strongly exploits the synergy between optical elements (such as waveguides, lenses or filters) and microfluidic networks (to ensure sample delivery), referred to as optofluidic. The fabrication of different components on the same glass substrate is made possible by the relatively novel technique of Femtosecond Laser Micromachining followed by Chemical Etching (FLICE). This thesis works aims at optimizing the structure of the already-existing devices for SPIM on chip, both from the optical and microfluidic points of views. A dual-colour dual-side illumination has been designed to provide aligned light sheets focused inside a microchannel by means of two hollow cylindrical lenses. The microfluidic network allows to flux biological specimens in the measuring region with a controlled speed; moreover, its shape has been optimized to handle the analysis of large samples, Drosophila melanogaster embryos, regulating their rotation for a better imaging.

Negli ultimi anni sono state proposte diverse tecniche per l'analisi e l'indagine di campioni biologici su scala micro- o nanometrica. In particolare, la microscopia di fluorescenza offre l'interessante possibilità di utilizzare appropriati marcatori fluorescenti solo su determinati "costrutti" all'interno di un campione (come, ad esempio, cellule, membrane, nuclei o proteine). L'immagine che ne risulta si staglia su uno sfondo quasi completamente nero ed è caratterizzata da un netto contrasto. Questo approccio presenta numerosi vantaggi, tra cui elevate specificità e selettività e la possibilità di ottenere, con un'alta risoluzione, immagini composite a più colori (a seconda dei marcatori). Non stupisce, quindi, che la microscopia di fluorescenza sia stata oggetto di un interesse crescente all'interno della comunità scientifica. Ereditando tutte le caratteristiche di questo tipo di microscopia, la tecnica SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy) permette di elevare la qualità dell'indagine biologica a livelli ancora più alti. Attraverso l'illuminazione del campione con un foglio di luce focalizzato è possibile effettuarne un "sezionamento ottico" piano per piano. Problemi come la fototossicità e l'inibizione della fluorescenza sono notevolmente ridotti; inoltre, le misure relative a ogni piano possono essere utilizzate per generare una ricostruzione tridimensionale del campione in esame, nella quale solo i costrutti marcati con i fluorofori sono visibili. Tuttavia, le procedure di montaggio e allineamento dei componenti ottici richiedono molto tempo, limitando le potenzialità della SPIM per analisi statistiche su un elevato numero di campioni. In aggiunta, le ingombranti apparecchiature di laboratorio richieste rendono impossibili misure in loco. L'integrazione della SPIM sui cosiddetti lab-on-chip promette di ridurre le procedure di montaggio e di garantire un efficace allineamento dei componenti ottici, rendendo la tecnica particolarmente adatta per rapide analisi di campioni numerosi. Il dispositivo che ne deriva sfrutta la sinergia tra elementi ottici, quali guide d'onda, lenti e filtri, e microfluidici, nota come optofluidica. La fabbricazione di componenti diversi sullo stesso substrato vetroso è resa possibile dal recente sviluppo della microfabbricazione tramite laser a femtosecondi. Lo scopo del presente lavoro di tesi è l'ottimizzazione di un dispositivo per SPIM su chip, dal punto di vista ottico e microfluidico. Due lenti cilindriche sono state progettate per generare all'interno di un microcanale due fogli di luce sovrapposti con due lunghezze d'onda di eccitazione. La rete microfluidica permette di controllare il flusso dei campioni biologici attraverso la regione di misurazione; inoltre, la sua forma è stata ottimizzata per garantire l'analisi di campioni di grandi dimensioni, gli embrioni di Drosophila melanogaster, controllandone la rotazione.