Tracking primary photoinduced processes in biomolecules by ultrafast UV spectroscopy

In the last decades, the study of ultrafast photoinduced processes in biomolecules has attracted much interest due to a variety of applications in medicine, photovoltaics and biophotonics. Thanks to ultrafast optical spectroscopy techniques, now it is possible to shed light on these processes, very important in living systems. In this work we exploited transient absorption (TA) spectroscopy and two-dimensional electronic spectroscopy (2DES). The first one represents one of the most powerful and versatile spectroscopy techniques: a first pulse, the pump, resonant with a transition of the system under study, brings the molecule to a photo-excited state whose relaxation mechanisms are tracked by measuring the absorption changes of a second delayed pulse, the probe. In order to study biomolecules, whose absorption is in the UV range, pump pulse needs to be tuned in this region. In the first part of the thesis, there is a description of our UV TA setup, based on a Ti:Sapphire laser. The ultrashort broadband UV pulses are generated by nonlinear processes (second harmonic or frequency up-conversion) on the output of a broadband visible non collinear optical parametric amplifier (NOPA); UV pulses are then characterized using two-dimensional spectral shearing interferometry (2DSI) technique, implemented with an optimized method developed in our laboratory. 2DES can be considered as an extension of the standard pump-probe spectroscopy, since with 2DES we are able to resolve the pump frequency dependence of the TA signals. In 2DES technique, the system is excited by three consecutive pulses, two pump pulses and a probe pulse, with controlled relative delays. The pulse sequence creates a macroscopic third-order nonlinear polarization that emits a field. Performing a double Fourier transform of the emitted signal, the 2D maps are retrieved as a function of pump and probe frequency. In the second chapter, we focus on the more sophisticated 2DES technique, extended to the UV range and on the novel method employed to generate two phase-locked collinear UV pulses as in this range, standard interferometric approaches would require very high accuracy to avoid the issue of vibrations of optical components. To overcome this problem, in our lab the TWINS (Translating-Wedge-based Identical pulse eNcoding System) device has been implemented, consisting in a simple and compact system which exploits birefringence to generate two phase-locked collinear pulses. The last part of this work focuses on the study of ultrafast relaxation dynamics of several biomolecules (trans-azobenzene, nucleosides and thiobases) through a combination of TA measurements with hybrid quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) simulations, performed by our partners in Bologna. Trans-azobenzene (AB) is a photo-chromic molecule which isomerizes if irradiated by light in the visible or in the UV range; the isomerization takes place on an ultrafast timescale and it involves a conformational change. Combining simulations with experimental results, we have suggested an explanation for some of the aspects still not clear regarding trans-AB relaxation after UV excitation and we could measure the lifetime of ππ* (~50 fs) state. In the relaxation pathway, the system decays via a sub-ps non reactive channel to the ground state through two conical intersections (CIs). Nucleosides are the building-blocks of nucleic acids (DNA and RNA) and they are constituted by a nucleobase (uracil, thymine, cytosine, adenine and guanine) and a five-carbon sugar, either ribose or deoxyribose. When nucleic acids absorb UV radiation, the electronic energy acquired by the molecules is converted into vibrational energy on an ultrafast timescale and with high efficiency, thus preventing photochemical reactions which might induce mutations or breaks in the nucleic acids strand. In those ultrafast photo-protective mechanisms, CIs play a crucial role and have been proposed as responsible for sub-picosecond fluorescence lifetimes in nucleobases. During the last years many studies have been performed to unravel photoexcitation dynamics in DNA, but most of them were limited by the temporal resolution (higher than 100 fs), thus thanks to our sub-20 fs pulse duration we can capture relaxation dynamics not observed experimentally yet: performing TA measurements on uridine and 5-methyluridine in water solutions upon pumping at 270 nm, for the first time it has been possible to observe in both nucleosides a stimulated emission band assigned to the photoexcited ππ* state and decaying on a ultrafast time scale (sub-100 fs); from simulations, we identified the ring puckering as the vibrational mode promoting the deactivation mechanism in both uridine and 5-methyluridine, excited by the 270-nm pump. A similar study has been performed in thiobases, which are modified nucleobases with a sulfur atom replacing an exocyclic carbonyl oxygen. With respect to canonical nucleobases, thiobases show a red-shift in the linear absorption spectra and significant changes in the photophysics, as the major relaxation pathway is via population of long-lived triplet states through intersystem crossing (ISC). For the first time we provided experimental evidence, supported by high-level simulations, that ISC occurs predominantly via a dark nπ* state, acting as intermediate; this intermediate state is populated on the sub-100 fs time scale as the system relaxes from the bright ππ* state, followed by ISC to the triplet state on the 500 fs timescale. Many are the future perspectives since thanks to UV tunability we could study several different systems (proteins, chain of nucleosides, different thiobases, azobenzene derivatives) and compare experimental data with calculations, in order to understand fundamental aspects of processes that could be related to the development of degenerative diseases or could have interesting and useful applications in biophotonics and medicine.

Negli ultimi decenni, lo studio dei processi fotoindotti in diverse classi di biomolecole ha suscitato un profondo interesse a causa della varietà delle applicazioni nel campo della medicina, del fotovoltaico e della biofotonica. Grazie alle tecniche di spettroscopia ottica ultraveloce, è possibile studiare questi processi, molto spesso fondamentali per i sistemi viventi. In questo lavoro di tesi abbiamo sfruttato tecniche di spettroscopia di assorbimento transiente (TA) e di spettroscopia elettronica bidimensionale (Two-Dimensional Electronic Spectroscopy, 2DES). La prima rappresenta una delle tecniche di spettroscopia più potenti e versatili: un primo impulso, la pompa, risonante con una transizione del sistema studiato, eccita la molecola; i processi di rilassamento sono seguiti misurando i cambiamenti di assorbimento di un secondo impulso ritardato, detto sonda. Per studiare le biomolecole, spesso caratterizzate da un assorbimento nell'ultravioletto, abbiamo bisogno di un impulso di pompa in questa regione. Nella prima parte della tesi, viene descritto il nostro apparato sperimentale per effettuare misure di TA nell’UV; il sistema è basato su un laser Ti: Zaffiro. Gli impulsi UV ultracorti sono generati sfruttando processi non lineari (seconda armonica o frequenza somma) sulla luce di un amplificatore parametrico ottico non collineare a banda larga (NOPA). Gli impulsi UV vengono quindi caratterizzati mediante tecnica di interferometria spettrale nota come "two-dimensional spectral shearing interferometry (2DSI)", implementata con un metodo sviluppato e ottimizzato nel nostro laboratorio. La tecnica di 2DES può essere considerata come un'estensione della spettroscopia TA standard; tramite 2DES siamo infatti in grado di risolvere il segnale lungo l’asse delle frequenze della pompa. In questa tecnica, il sistema è eccitato da tre impulsi consecutivi, due di pompa e uno di sonda, i cui rispettivi ritardi relativi vengono controllati. La sequenza di impulsi crea una polarizzazione macroscopica non lineare di terzo ordine, che emette un campo. Facendo una doppia trasformata di Fourier del segnale emesso, le mappe 2D vengono ricostruite in funzione della frequenza della pompa e della sonda. Il secondo capitolo della tesi è incentrato sulla tecnica di 2DES, estesa nella regione UV e sul nuovo metodo impiegato per generare due impulsi collineari "phase-locked", aggangiati in fase, nell’UV, il che, utilizzando approcci interferometrici standard richiederebbe un'accuratezza molto elevata per evitare le vibrazioni dei componenti ottici. Per risolvere il problema, nel nostro laboratorio è stato implementato il dispositivo TWINS (Translating-Wedge-based Identical pulse eNcoding System), costituito da un sistema semplice e compatto che sfrutta la birifrangenza per generare due impulsi agganciati in fase. Nell’ultima parte della tesi, viene presentato lo studio della dinamica di rilassamento ultraveloce di diverse biomolecole (trans-azobenzene, nucleosidi e tiobasi) attraverso la combinazione di misure sperimentali di TA e di simulazioni di meccanica quantistica ibrida / meccanica molecolare (QM / MM), eseguite dai nostri collaboratori a Bologna. Il trans-azobenzene (AB) è una molecola foto-cromica che isomerizza se viene irradiata dalla luce visibile o ultravioletta; l'isomerizzazione avviene in tempi estremamente rapidi e comporta un cambiamento conformazionale. Combinando le simulazioni con i risultati sperimentali, abbiamo formulato una spiegazione per alcuni degli aspetti ancora non chiari riguardanti il rilassamento del trans-AB in seguito ad eccitazione tramite luce UV e abbiamo misurato il tempo di vita dello stato ππ * (~ 50 fs). Nei processi di rilassamento, il sistema decade in una scala temporale dell’ordine del sub-ps, tramite un canale non reattivo verso lo stato fondamentale, attraverso due intersezioni coniche (IC). I nucleosidi sono gli elementi base degli acidi nucleici (DNA e RNA) e sono costituiti da una nucleobase (uracile, timina, citosina, adenina e guanina) e uno zucchero a cinque atomi di carbonio, il ribosio o desossiribosio. Quando gli acidi nucleici assorbono la radiazione UV, l'energia elettronica acquisita dalle molecole viene convertita in energia vibrazionale su una scala temporale ultraveloce e in un processo molto efficiente; in questo modo si evita di indurre mutazioni o rotture nel filamento degli acidi nucleici. In quei meccanismi di foto-protezione, le IC giocano un ruolo cruciale e sono state proposte come responsabili della durata della fluorescenza dell’ordine dei sub-ps nelle nucleobasi. Negli ultimi anni sono stati effettuati molti studi per svelare le dinamiche di fotoeccitazione nel DNA, ma nella maggior parte di essi, il limite è stato la risoluzione temporale (superiore a 100 fs); perciò grazie alla nostra risoluzione, inferiore a 20 fs, possiamo studiare le dinamiche di rilassamento, non ancora direttamente osservate a livello sperimentale: abbiamo misurato uridina e 5-metiluridina in soluzione acquosa, eccitando con un impulso a 270 nm; per la prima volta, è stato possibile osservare in entrambi i nucleosidi una banda di emissione stimolata, assegnata allo stato fotoeccitato ππ* e caratterizzata da un decadimento ultraveloce (scala temporale inferiore a 100 fs); grazie alle simulazioni, abbiamo identificato il “ring puckering” come il modo attraverso cui si hanno processi di rilassamento sia nell'urina che nella 5-metiluridina. Uno studio simile è stato condotto anche sulle tiobasi, nucleobasi in cui un atomo di ossigeno è stato sostituito da uno di zolfo. Le tiobasi mostrano un assorbimento spostato verso il rosso e cambiamenti significativi nella fotofisica: dopo la fotoeccitazione, il rilassamento avviene attraverso la popolazione di stati di tripletto tramite intersystem-crossing (ISC). Per la prima volta abbiamo osservato sperimentalmente che il processo di ISC si verifica attraverso uno stato intermedio nπ *; questo stato intermedio è popolato sulla scala temporale dell’odine di 100 fs, quando il sistema si rilassa dallo stato eccitato ππ *, ed è seguito da ISC allo stato di tripletto (500 fs). Molti sono i possibili sviluppi futuri poiché sarebbe interessante studiare diversi sistemi (proteine, catene di nucleosidi, diverse tiobasi, derivati dell'azobenzene) e confrontare i dati sperimentali con i calcoli, al fine di comprendere aspetti fondamentali dei processi che potrebbero essere correlati allo sviluppo di malattie degenerative o potrebbero avere grandi potenzialità in biofotonica e medicina.