Biopolymer fibrous networks for tissue engineering applications

The development of 3D fibrous networks from natural occurring polymers have always attracted considerable attention as platform for tissue engineering applications. Opportunely arranged micro/nano-scaled fibers, in fact, are an attractive architecture per se, for offering an intrinsically porous structure and a high surface to volume ratio. The combination of three-dimensional networks with natural polymers allows the production of matrices that can not only mimic the architecture of the native extra-cellular matrix (ECM), but also present specific chemical cues. In this scenario, the research activity presented in this thesis is focused on the development of biopolymer fibrous networks using different approaches: the first one consisted in using protein fiber networks as scaffolding material for cell seeding; in the second approach alginate-based microfibers were used for cell encapsulation. Accordingly, two different fabrication methods, electrospinning and wet-spinning respectively, were used to prepare fibrous hydrogel structures. More specifically, the first section is focused on the electrospinning technique involving natural polymers. This simple method allows to obtain interconnected nanofibrous scaffold with great potential as support for tissue engineering. Among natural polymers, gelatin is considered excellent biopolymer for this aim, due to its biocompatibility and biomimicry properties. Despite all its advantages, cross-linking is generally required to achieve the necessary stability and adjust scaffold degradation rate. When electrospun substrates are involved, cross-linking procedure should not only increase stability but also preserve nanofiber morphology and interconnected porous structure. Thus, an innovative crosslinking protocol was developed using carbodiimide chemistry. The introduction of a different solvent (acetonitrile) together with the application of a controlled mechanical tensioning during the crosslinking process allowed to define a new EDC/NHS crosslinking protocol. The crosslinking protocol was validated by means of morphological characterization, degradation test, mechanical and biological test on crosslinked fibrous mats. In the second section wet-spinning technique was described to produce micro-fibrous 3D networks from ionically crosslinked hydrogel. To purse a cell embedding strategy, the development of a purpose-designed simple circuit for cell encapsulation in hydrogel microfibrous scaffolds is presented and its effectiveness for cell delivery using fast degradable, alginate-based materials is validated. Due to its rapid gelation mechanism under mild conditions, alginate resulted an optimal candidate material to test the developed flow circuit. To fabricate the scaffold, cells suspended in hydrogel-precursor are injected in a closed-loop circuit, where a centrifugal pump circulates the cross-linking solution. The flow stretches and solidifies a continuous micro-scaled, cell-loaded fiber that whips, bends and is collected in a strainer as a self-standing fibrous scaffold. The versatility of this system represents a practical alternative to more refined (but significantly more complex) methods available for encapsulation in hydrogel fibers. As different material formulations can be processed to create homogeneously cell-populated structures, this system appears as a valuable, widespread available platform, not only for cell delivery, but also, more in general, for 3D cell culturing in vitro. Both these applications were investigated using alginate, blend-modified alginate and chemical-modified alginate solutions in order to increase the ability of the scaffold to resemble ECM features. Both the approaches pursued in this thesis through the development of biopolymer-based fibrous networks resulted efficient in producing cell-free and cell-laden scaffold with advantageous features for tissue engineering applications.

Il presente lavoro di tesi si focalizza sullo sviluppo di network fibrosi come supporti per la rigenerazione tissutale a seguito di lesioni. Lo scopo principale dell’attività di ricerca presentata è quello di valutare come una specifica architettura in combinazione con l’utilizzo di polimeri naturali possa essere vantaggiosa nello sviluppo di scaffold per tissue engineering. L’organizzazione casuale di un network fibroso offre infatti numerosi vantaggi, quali la possibilità di garantire una perfusione completa di tutto il costrutto e la capacità di offrire un’elevata superficie di ancoraggio alle cellule colonizzanti la struttura. La combinazione di network tridimensionali e biopolimeri consente di ottenere strutture capaci non solo di imitare l'architettura della matrice extracellulare nativa (ECM), ma anche di presentare specifici segnali chimici utili alla proliferazione cellulare. In questo scenario, l'attività di ricerca presentata in questa tesi è incentrata sullo sviluppo di network fibrosi utilizzando due approcci differenti: il primo consiste nell'utilizzo di scaffold fibrosi come supporti per la semina cellulare; il secondo approccio prevede invece l’utilizzo di microfibre a base di alginato per l'incapsulamento cellulare. Sono stati utilizzati due diversi metodi di fabbricazione, l'elettrofilatura e l’estrusione, per ottenere le due differenti strutture fibrose. Nella prima parte, grazie alla tecnica di electrospinning sono state prodotte strutture fibrose composte da fibre di dimensioni nanometriche. Il materiale impiegato per lo sviluppo di questi costrutti è la gelatina, biopolimero ottenuto dalla denaturazione del collagene che presenta ottime proprietà di biocompatibilità. Tuttavia, le strutture a base di collagene risultano solubili in ambiente acquoso e necessitano quindi di una stabilizzazione per poter essere impiegate come scaffold per la rigenerazione dei tessuti. A questo scopo, uno studio approfondito ha permesso di individuare un protocollo di reticolazione efficiente, tenendo in considerazione l’importanza del mantenimento della topografia fibrosa ottenuta tramite elettrofilatura. La reticolazione mediante carbodiimide è risultata efficace e l’ottimizzazione dei parametri coinvolti nel processo (solvente, concentrazione reticolante, tempi e set-up di reticolazione) ha permesso di ottenere strutture fibrose stabili in ambiente acquoso. Nella seconda parte di questo lavoro di tesi, l’alginato è stato utilizzato come materiale per la realizzazione di microfibre grazie al suo rapido ed efficace meccanismo di reticolazione in presenza di ioni divalenti. E’ stato progettato e realizzato un circuito di flusso per permettere l’incapsulamento di cellule all’interno delle microfibre di alginato. Una soluzione contenente ioni calcio è fatta circolare all’interno del circuito nel quale viene iniettata la sospensione alginato-cellule. Le forze di stiramento della soluzione reticolante permettono di ottenere delle fibre che si assemblano in un reticolo compatto all’interno del sistema. Questo costrutto fibroso è stato impiegato per due scopi principali: come sistema di rilascio di cellule e come scaffold per la rigenerazione tissutale. La versatilità del sistema progettato ha permesso di ottenere scaffold con diverse composizioni e di valutare il comportamento al suo interno sia di cellule di linea che di cellule staminali. Entrambi gli approcci investigati hanno permesso di concludere che l’utilizzo di polimeri naturali e di architetture fibrose presenta numerosi vantaggi nell’ottenimento di strutture capaci di mimare le caratteristiche principali della matrice extracellulare nativa.