Optimization of a flow focusing microfluidic chip for pancreatic islets encapsulation

Introduction and state of the art The pancreas is one of the largest glands in human body, capable of performing both a digestive and a hormonal function. In particular, pancreas has both an endocrine component, namely the islets of Langerhans secreting insulin and glucagon, and an exocrine component, consisting of clusters that produce pancreatic juice, rich in digestive enzymes [1,2]. Diabetes Mellitus is a disease caused by metabolic disorders related to proteins, fats and carbohydrates, which is characterized by hyperglycemia. This disease may occur in two forms: type I diabetes caused by insufficient insulin secretion by β cells – which make up a part of the pancreatic islets' cells -, or type II diabetes caused by body tissues' decreased sensitivity to insulin [5,6]. Currently, diabetes is treated by administering insulin in order to restore adequate blood sugar levels as well as a normal metabolism of fats, proteins and carbohydrates. In the most severe cases of type I diabetes, in which patients' condition has reached an advanced stage, the entire pancreas transplantation can be performed. As an alternative, a new approach is currently under study and investigation, based on the transplantation of pancreatic islets isolated from an allogeneic source. However, transplantation techniques face several limitations, such as the small number of donors and the need for immunosuppressive therapy to avoid recipient's rejection after organ or tissue transplantation [10-15]. To protect the donor's pancreatic cells from the recipient's immune system, thus to avoid immunological rejection, an innovative strategy consists in the exploitation of the concept of cellular immunization. In detail, the islets of Langerhans are encapsulated in a polymer membrane selectively permeable to small substances such as oxygen, nutrients, insulin and glucose, but impermeable to humoral components and to recipient's immune system, which could trigger an immune response [17,18]. More specifically, a single or small number of pancreatic islets are encapsulated in a spherical micro-camera with selective properties and mechanical stability, using microencapsulation strategy [26,27]. This innovative strategy has led to the development of an optimised method for obtaining ever smaller polymer capsules that individually incorporate pancreatic islets. The final result is to significantly reduce the thickness of the polymeric membrane, obtaining a thin mambrane layer able to wrap around the pancreatic islet, adapting to its size and morphology with a strategy called conformal coating. Accordingly, the reduction of the capsule's thickness and its size can lead to a consequent minimization of the implant volume, leading to a significant reduction of the time of diffusion of metabolites able to spot glucose and release insulin more quickly. Therefore, transplantation is possible in small but well vascularized sites such as the epididymal adipose pocket [29]. In the past and recent years, microfluidics has provided important tools for the study of the generation of stable and controlled emulsion phenomena, but also of the synthesis of polymeric particles [30-32]. In particular, for the synthesis of polymeric particles, a dispersed phase, usually composed of a polymerizable fluid, is emulsified in another immiscible liquid called continuous phase for the continuous generation of polymeric drops that flow separately within the continuous phase. The polymeric capsules obtained crosslink through different methods of polymerization: thermally induced, pH dependent or photo induced. In addition to this, soft lithography has allowed the development of cellular encapsulation devices presenting advantages in terms of cost, size reduction of the experimental platform, smaller amount of reagents and reduced experimental time [40-52]. In experimental literature, the encapsulation of pancreatic islets using microfluidic devices with a hydrodynamic focusing geometry has been poorly discussed despite the advantages presented by soft lithographic techniques and the growing interest in new efficient, reproducible and stable coating strategies for this type of cells [59,60]. The aim of this thesis is to produce and test two optimized versions of a microfluidic device, previously tested, with an innovative hydrodynamic geometry for the encapsulation of pancreatic islets in microcapsules of controlled size. Materials and methods Two optimized versions of a microfluidic chip, characterized by an innovative hydrodynamic geometry (Needle) and previously tested, have been designed and manufactured. The 2D representation shows common characteristics between the Optimized and Original Needle chips (figure 1). The optimization of the Needle chip is based on four main aspects. More specifically, the central focusing channel in which the clusters flow has been expanded from 160 µm to 240 µm to promote the passage of clusters with a larger diameter. In addition, a different arrangement of the microfluidic channels has been designed and the latter have been made higher. Finally, the most significant innovation concerns a different method of injection of the dispersed phase and the continuous one for the generation of emulsion phenomena and the consequent formation of polymeric capsules. More in detail, the dispersed phase is the water phase, consisting of two essential components for the generation of polymeric capsules (PEG-MAL and crosslinker), while the continuous phase is the oil phase consisting of PPG and Span80. Since the microfluidic chips are composed of three inlets, i.e. three injection points of the phases, three different flow rates (Q) for the injection of the two phases into the devices (figure 2) will be identified. In the Original Needle chip, Qlateral and Qshell refer to the flow rates of the oil phases that flow in the outer channels, while Qcore refers to the flow rate of the water phase consisting of PEG-MAL and crosslinker which are injected together in the inner inlet. In the two optimized versions of the Needle chips, Qlateral remains the flow rate of the oil phase that flows in the outer channel, while the two constituents of the water phase are injected separately in two different inlets. Specifically, the crosslinker, whose flow rate is Qshell, is inserted into the chip through the middle inlet and PEG-MAL, whose flow rate is Qcore, flows into the inner channel. Figure 1. 2D representation of the geometries of the two chips (Optimized e Original) showing their common characteristics: resistive channels, central encapsulation portion, main channel and observation hedgehog. Figura 2 Schematic of Optimized and Original Needle chips showing the upper part showing the inlet flow rates. Inside the black circle the central encapsulation channel is shown. The green circle points out the different position of the external channel. The microfluidic layouts were designed using CAD software (AutoCAD, Autodesk Inc.) and the corresponding master molds were created using photolithography techniques. PDMS (Elastomeric Base and Crosslinker Agent, Dow Corning, 184 Sylgard) was poured onto the master mold at a ratio of 10:1 w/w (pre-polymer/ crosslinker agent) to obtain a single layer, namely half of the devices tested through the replication molding process. Subsequently, these layers were perforated next to the inlets to allow the needle or tube to enter inside the chip and finally were manually lined up under a stereomicroscope, following a plasma treatment (Harrick plasma), in order to close the channels and use the chip. Tygon (Cole-Parmer) and polyethylene (Intramedic, Clay Adams brand) tubes were used to connect the microfluidic chips with the syringe pumps. The experimental setup necessary to test the devices and carry out the encapsulation process involved three syringe pumps (Harvard apparatus PHD Ultra) set with the correct flow rate values and a stereomicroscope (Motic SMZ-171) to observe the encapsulation process. Then, at least three microfluidic devices for each optimized version as well as either water or oil phase solutions depending on the test, tygon and polyethylene tubes, 3ml Hamilton syringes for the water phases, disposable Luer Lock for the oil phase and hypodermic needles were checked to be ready for the experiment. As far as the oil phase is concerned, polypropylene glycol (PPG) was used, which is a mainly hydrophobic oil with a viscosity of 1400 cp at 25°C and Span80, a supernatant capable of lowering surface tension. For the water phase, the temperature and pH sensitivity of the reaction between PEG-MAL (8ARM(TP)-MAL-10K-75%, JenKem Technology) and SH-PEH-SH (Creative PEGworks) was used, in order to obtain a stable pregel capable of separating into drops. The first test was carried out using water and trypan blue for the water phase in order to find the optimal conditions for jetting to dripping. Subsequently, the microfluidic chips were tested with PEG-MAL and crosslinker to study the phenomenon of jetting to dripping and analyze the process of generating polymeric capsules. Finally, the last experiments were conducted using PS beads and then MIN6 clusters in addition to the water phase to study the potential of devices in the process of encapsulation of microparticles. Results To verify that the channel heights corresponded to the design specifications and to be able to compare the results with the Original Needle chip, three different thin sections for each Optimized Needle chip were made and observed with a stereomicroscope. ORIGINAL NEEDLE OPTIMIZED NEEDLE 160 µm OPTIMIZED NEEDLE 240 µm Canali resistivi 79,440 ± 2,269 μm 89,691 ± 3,047 µm 84,958 ± 1,923 µm Canale principale 265,199 ± 1,210 μm 231,496 ± 5,22 µm 223,973 ± 4,352 µm Riccio di osservazione 214,643 ± 4,476 μm 237,136 ± 5,711 µm 236,7 ± 4,488 µm Table 1 Height values related to the Original Needle chip and the two Optimized Needle chips. Data are shown considering average values and standard deviation. N>10 measurements were performed for each analyzed section and three different chips for each category were sectioned to obtain the above mentioned values. Subsequently, further sections were carried out to specifically verify the dimensions of the central encapsulation channels of both Optimized Needle chips. OPTIMIZED NEEDLE 160 µm OPTIMIZED NEEDLE 240 µm Canale centrale di incapsulamento 161,038 ± 2,276 µm 241,659 ± 3,463 µm Table 2. Length values for the central encapsulation channels of each Otpimized Needle chip. Data are shown considering average values and standard deviation. N>10 measurements were performed for each analyzed section and three different chips for each category were sectioned to obtain the above mentioned values. The first test carried out with the chips was performed using water and trypan blue for the water phase, to assess the optimal conditions of jetting to dripping. Specifically, two tests were carried out: in the first one the flow rate of the oil phase was kept constant and whereas the one of the water phase was gradually increased. Conversely, in the second one the flow rate of the water phase was kept constant, at the optimal value found in the previous test, and the one of the oil phase was gradually increased. Table 3. Schematic showing the impact of water phase flow rate on capsule dimension for both optimized Needle chips. Table 4 showing the impact of oil phase flow rate on capsule dimension for both optimized Needle chips. for both optimized Needle chips. It is evident that the gradual increase in the flow rate of the water phase corresponds to a significant increase in the diameter of the polymeric capsules generated (table 3). On the contrary, by gradually increasing the flow rate of the oil phase, no significant differences in the jetting to dripping profile are observed (table 4). A test with polymeric reagents (PEG-MAL and crosslinker) was then performed to evaluate the potential of the chips to generate polymer capsules. Both Optimized Needle chips generated polymeric capsules with different diameters depending on the imposed flow rate set. In particular, the increase in the flow rate of the water phase has a greater effect on the diameter of the capsules than the increase in the flow rate of the oil phase (Figure 3). Figure 3. Quantification of the capsule diameter variation as a function of the imposed flow rate, analyzing the capsules after collection and purification. A number of N>20 capsules was measured . Figure 4. Image showing the jetting to dripping phenomenon leading to the formation of polymer capsules and microscope images after purification process. The phenomenon of jetting to dripping occurs regularly with an initial jet that breaks forming spherical polymeric drops. In addition, the post-purification spheres appear with a well-defined spherical shape (Figure 4). The two optimized chips were finally tested using 100 µm diameter polystyrene (PS) beads and MIN6 clusters. Figure 5. Quantification of the capsule diameter variation as a function of the imposed flow rate, analyzing the capsules after collection and purification a) for the chips tested with polystyrene beads , b) for the chips tested with MIN6 clusters, analyzing the capsules after collection and purification. A number of N>20 capsules was measured . Although the formation of polymer capsules takes place on a regular basis just below the central channel, both the polystyrene beads and the MIN6 clusters have a significant difficulty to slide inside the chip for encapsulation. There is no constant and regular flow of beads and clusters. Only a very small number of these microparticles flow into the chip and are encapsulated. Discussions e conclusions The two optimized versions of the Needle chips showed no significant differences in their operation. Accordingly, both are capable of generating single-dispersed drops in a controlled manner as the imposed flow rate set varies. Jetting to dripping, a phenomenon at the base of conformal coating, appears well defined with an initial jet that breaks generating droplets of micrometric size that generate spherical polymer capsules. The limitations of the optimized Needle chips concern the encapsulation process of microparticles such as polystyrene beads and MIN6 clsuters. In particular, the difficulty of obtaining a constant and continuous flow of spheres or clusters is the main obstacle of the devices tested. Despite the continuous formation of polymer capsules, only a very small number of microparticles flow inside the chip channel and are encapsulated. In fact, the geometry of the chip and the new arrangement of the channels compared to the original Needle, imposes low flow rate values of the water phase to achieve jetting to dripping. The beads or MIN6 clusters, being suspended in the water phase, are subject to the same flow rates, whose values are insufficient to promote a continuous and steady flow of microparticles and promote their movement along the channels. Therefore, the latter remain stuck inside the tube and accumulate. In addition, the partial misalignment of the two layers of the chip is another factor that can partly affect the encapsulation process. Manual alignment under the stereomicroscope inevitably leads to error, considering that the size of the chip is in the order of micrometers. This error translates into a variation of the passage section of the fluid, which in turn influences the speed of the two phases also favoring the formation of air bubbles. The two optimized Needle chips tested in this study were obtained from the improvement of the original Needle chip and they represent an innovation based on the presence of a central encapsulation region characterized by a flow focusing geometry. The devide has proved to be able to encapsulate microparticles in a compliant way in monodisperse polymeric drops. However, the method of simultaneous injection of the components of the water phase, PEG-MAL and crosslinker, in a single inlet forces to keep the pH at a low value, avoiding instantaneous freezing but causing cell suffering. The two optimized versions of this Needle chip have been designed to be able to separately inject PEG-MAL and crosslinker keeping the pH of the two components at different values in order to favor the cells and avoid an instantaneous gelation. Although this modification represents an important point for the improvement of these soft lithographic devices for the encapsulation of pancreatic cells, the two optimized Needle chips have not shown the same results in terms of encapsulation and conformal coating as their predecessor suggesting a geometric modification and a new arrangement of the channels in order to obtain a regular and constant encapsulation process.

Introduzione e stato dell’arte Il pancreas è una delle più grandi ghiandole del nostro corpo in grado di svolgere una funzione digestiva e ormonale. In particolare si può distinguere una componente endocrina, costituita da isole di Langerhans che secernono insulina e glucagone, e una componente esocrina costituita da acini che producono il succo pancreatico, fluido ricco di enzimi digestivi [1,2]. Il diabete Mellito è una patologia che si riferisci a un gruppo di disordini metabolici di proteine, grassi e carboidrati, caratterizzati da iperglicemia. Questa malattia può manifestarsi in due forme: Diabete di tipo I causata da una mancanza di secrezione di insulina da parte delle cellule β, una porzione di componente cellulare che costituisce le isole pancreatiche, o Diabete di tipo II dovuto a una diminuita sensibilità dei tessuti del corpo all’insulina [5,6]. I trattamenti che vengono utilizzati oggigiorno per la cura del diabete si basano sulla somministrazione di insulina per ristabilire degli adeguati livelli di glicemia ed avere un metabolismo di grassi, proteine e carboidrati il più normale possibili. Nei casi più severi di Diabete di tipo I nei quali il paziente mostra un livello avanzato della patologia, un intervento di trapianto dell’intero pancreas può essere eseguito. Come alternativa ai trattamenti odierni, un nuovo approccio, in fase di studio e investigazione, si basa sul trapianto di isole pancreatiche isolate da una sorgente allogenica. Tuttavia le tecniche di trapianto devono affrontare diverse limitazioni come il numero ridotto di donatori di pancreas e la necessità di effettuare una terapia immunosoppressiva per evitare fenomeni di rigetto come conseguenza del trapianto di organi o tessuti da parte di un donatore [10-15]. Per proteggere le cellule pancreatiche del donatore da parte del sistema immunitario dell’ospite ed evitare così il rigetto immunologico, una strategia innovativa si basa sullo sfruttamento del concetto di immunoisolamento cellulare. In dettaglio le isole di Langerhans vengono incapsulate in una membrana polimerica permeabile selettivamente a sostanze di piccole dimensioni quali ossigeno, nutrienti, insulina e glucosio ma impermeabile ai componenti umorali e del sistema immunitario dell’ospite che possano far scaturire una risposta immunitaria [17,18]. Nello specifico una singola isola pancreatica o un numero ristretto di essere vengono incapsulate in una micro-camera sferica con proprietà selettive e di stabilità meccanica attraverso la strategia di microincapsulamento [26,27]. Da questa strategia innovativa è stata studiato un metodo ottimizzato che consente di ottenere capsule di polimero di dimensioni sempre più piccole e inglobare singolarmente isole pancreatiche. Il risultato finale è quello di ridurre notevolmente lo spessore della membrana polimerica ottenendo un sottile strato di membrana che avvolge l’isola pancreatica adattandosi alle sue dimensioni e morfologia con una strategia denominata conformal coating. La riduzione dello spessore della capsula e le dimensioni della stessa possono portare a una conseguente minimizzazione del volume di impianto e una significativa riduzione dei tempi di diffusione di metaboliti consentendo di percepire il glucosio e rilasciare insulina in tempi più rapidi e permettendo il trapianto in siti piccoli ma ben vascolarizzati come la tasca adiposa epididimale [29]. Negli anni passati e recenti, la microfluidica ha fornito strumenti importanti per lo studio della generazione di fenomeni di emulsione stabili e controllati ma anche della sintesi di particelle polimeriche [30-32]. Nel dettaglio per la sintesi di particelle polimeriche una fase dispersa, solitamente composta da un fluido polimerizzabile viene emulsionata in un altro liquido immiscibile chiamato fase continua per la generazione continua di gocce polimeriche che scorrono all’interno della fase continua separate tra loro. Le capsule polimeriche ottenute reticolano attraverso diversi metodi di polimerizzazione: termicamente indotta, Ph dipendente o foto indotta. In aggiunta a ciò, la soft litografia ha permesso lo sviluppo di dispositivi per l’incapsulamento cellulare che presentano diversi vantaggi in termini di costo, riduzione delle dimensioni della piattaforma sperimentale, di una quantità minore di reagenti e riduzione dei tempo sperimentali [40-52]. Secondo le evidenze sperimentali di letteratura, l’incapsulamento di isole pancreatiche sfruttando dispositivi microfluidici con una geometria di focusing idrodinamico è stato scarsamente discusso nonostante i vantaggi presentati dalle tecniche soft litografiche e l’interesse crescente per nuove strategie di coating efficienti, riproducibili e stabili per questo tipo di cellule [59,60]. Lo scopo della presente tesi è quello di fabbricare e testare due versioni ottimizzate di un dispositivo microfluidico, precedentemente testato, con una geometria innovativa di focusing idrodinamico per l’incapsulamento di isole pancreatiche in microcapsule dalla dimensione controllata, focalizzandosi maggiormente sui principali limiti presentati dal precedente dispositivo. Materiali e metodi Due versioni ottimizzate di un chip microfluidico, caratterizzato da una geometria innovativa di focusing idrodinamico (Needle) e precedentemente testato, sono state disegnate e fabbricate. Dalla rappresentazione 2D è possibile osservare caratteristiche comuni tra gli Optimized e Original Needle chip (figura 1). Le grandi differenze sulle quali si basa l’ottimizzazione del chip Needle riguardano principalmente quattro aspetti. Nello specifico il canale centrale di focusing nel quale scorrono i cluster è stato allargato da 160 µm a 240 µm per promuovere il passaggio di cluster di diametro maggiore. Inoltre è stata progettata una diversa disposizione dei canali microfluidici e quest’ultimi sono stati resi più alti. Infine la più significativa innovazione riguarda una diverso metodo di iniezione delle fasi dispersa e continua per la generazione di fenomeni di emulsione e conseguente formazione di capsule polimeriche. Analizzando più nel dettaglio quest’ultimo punto la fase dispersa è la fase acqua, costituita da due componenti essenziali per la generazione di capsule polimeriche (PEG-MAL e crosslinker), mentre la fase continua è la fase olio costituita da PPG e Span80. Essendo i chip microfluidici composti da tre inlet, ossia tre punti di iniezione delle fasi, si avranno dunque tre diverse portate (Q) con le quali saranno iniettate all’interno dei dispositivi le due fasi (figura 2). Nel dettaglio, nell’Original Needle chip Qlateral e Qshell si riferiscono alle portate delle fasi olio che scorrono nei canali più esterni mentre Qcore si riferisce alla portata della fase acqua composta da PEG-MAL e crosslinker che vengono iniettati insieme nell’inlet più interno. Nelle due versioni ottimizzate del Needle chip Qlateral rimane la portata della fase olio che scorre nel canale più esterno mentre i due costituenti della fase acqua vengono iniettati separatamente in due diversi inlet. Nello specifico il crosslinker, la cui portata è Qshell, viene inserito nel chip attraverso l’inlet di mezzo e il PEG-MAL con la portata Qcore scorre nel canale più interno. Figura 1 Rappresentazione 2D delle geometrie dei due chip (Optimized e Original) con diverse caratteristiche comuni evidenziate: canali resistivi, porzione centrale di incapsulamento, canale principale, riccio di osservazione. Figura 2 Rappresentazione della porzione superiore del chip Needle ottimizzato e originale dove sono indicate le portate per ciascun inlet. In nero è indicato il canale centrale di incapsulamento mentre in verde la diversa disposizione del canale esterno. I layout microfluidici sono stati disegnati mediante un software CAD (AutoCAD, Autodesk Inc.) e i corrispondenti master mold sono stati realizzati mediante tecniche di fotolitografia. Il PDMS (Base elastomerica e agente reticolante, Dow Corning, 184 Sylgard) è stato colato sul master mold in rapporto 10:1 w/w (pre-polimero/agente reticolante) per ottenere un singolo strato ossia una metà dei dispositivi testati attraverso il processo di replica molding. Questi strati sono stati perforati in corrispondenza degli inlet per permettere l’ingresso dell’ago o tubo all’interno del chip e infine sono stati allineati a mano sotto uno stereomicroscopio, in seguito ad un trattamento al plasma (Harrick plasma) , per chiudere i canali e poter utilizzare il chip. Tubi tygon (Cole-Parmer) e polietilene (Intramedic, Clay Adams brand) sono stati utilizzati per connettere i chip microfluidici con le pompe a siringa. Il setup sperimentale necessario per testare i dispositivi e realizzare il processo di incapsulamento prevedeva tre pompe a siringa (Harvard apparatus PHD Ultra) impostate con i corretti valori di portata, uno stereomicroscopio (Motic SMZ-171) per osservare il processo di incapsulamento. Successivamente almeno tre dispositivi microfluidici per ciascuna versione ottimizzata, soluzioni di fasi acqua e olio a seconda del test svolto, tubi tygon e polietilene, siringhe Hamilton da 3ml per le fasi acqua e Luer Lock monouso per la fase olio e aghi ipodermici sono stati controllati per essere pronti sulla postazione di lavoro. Per quanto riguarda la fase olio è stato impiegato il polipropilene glicole (PPG) ossia un olio principalmente idrofobico con una viscosità di 1400 cp a 25°C e Span80, un surnatante in grado di abbassare la tensione superficiale. Per la fase acqua è stata sfruttata la sensitività alla temperatura e al Ph della reazione tra il PEG-MAL (8ARM(TP)-MAL-10K-75%, JenKem Technology) con il SH-PEH-SH (Creative PEGworks), in modo da ottenere un pregel stabile in grado di essere separato in gocce. Il primo test è stato effettuato utilizzando acqua e trypan blue per la fase acqua con lo scopo di trovare le condizioni ottimali per il jetting to dripping ossia il fenomeno di base del conformal coating. Successivamente i chip microfluidici sono stati testati con PEG-MAL e crosslinker per studiare il fenomeno del jetting to dripping e analizzare il processo di generazione delle capsule polimeriche. Infine gli ultimi esperimenti sono stati condotti utilizzando PS beads e successivamente MIN6 clusters in aggiunta alla fase acqua per studiare la potenzialità dei dispositivi nel processo di incapsulamento di microparticelle. Risultati Per verificare che le altezze dei canali fossero corrispondenti con le specifiche di progetto e per poter comparare i risultati con l’Original Needle chip, tre diverse sezioni sottili per ciascuno Optimized Needle chip sono state effettuate e osservate con uno stereomicroscopio. ORIGINAL NEEDLE OPTIMIZED NEEDLE 160 µm OPTIMIZED NEEDLE 240 µm Canali resistivi 79,440 ± 2,269 μm 89,691 ± 3,047 µm 84,958 ± 1,923 µm Canale principale 265,199 ± 1,210 μm 231,496 ± 5,22 µm 223,973 ± 4,352 µm Riccio di osservazione 214,643 ± 4,476 μm 237,136 ± 5,711 µm 236,7 ± 4,488 µm Tabella 1 Valori di altezza riferiti all’Original Needle chip e ai due Optimized Needle chip. I dati vengono mostrati con i valori medi e le deviazioni standard. N>10 misurazioni sono state effettuate per ciascuna sezione analizzata e tre diversi chip per ciascuna categoria sono stati sezionati per ottenere i valori sopra menzionati. Successivamente ulteriori sezioni sono state effettuate per verificare in particolare le dimensioni dei canali centrali di incapsulamento di entrambi gli Optimized Needle chip. OPTIMIZED NEEDLE 160 µm OPTIMIZED NEEDLE 240 µm Canale centrale di incapsulamento 161,038 ± 2,276 µm 241,659 ± 3,463 µm Tabella 2. Valori di larghezza per i canali centrali di incapsulamento per ciascuno degli Otpimized Needle chip. I dati vengono mostrati con i valori medi e le deviazioni standard. N>10 misurazioni sono state effettuate per ciascuna sezione analizzata e tre diversi chip per ciascuna categoria sono stati sezionati per ottenere i valori sopra menzionati. Il primo test effettuato con i chip è stato eseguito utilizzando acqua e trypan blue per quanto riguarda la fase acqua, per valutare le condizioni ottimali di jetting to dripping. Nello specifico due test sono stati eseguiti: il primo tenendo costante la portata della fase olio e aumentando gradualmente quella della fase acque e il secondo mantenendo costante la portata della fase acque, al valore ottimale trovato nel test precedente, e aumentando gradualmente quella della fase olio. Tabella 3. Rappresentazione dell’effetto dell’incremento della portata della fase acqua sulla dimensione delle capsule per entrambi i chip Needle ottimizzati. Tabella 4. Rappresentazione dell’effetto dell’incremento della portata della fase olio sulla dimensione delle capsule per entrambi i chip Needle ottimizzati. Aumentando gradualmente la portata della fase acqua si assiste ad un aumento significativo del diametro delle capsule polimeriche generate (tabella 3). Al contrario aumentando gradualmente la portata della fase olio non si osservano significative differenze nel profilo del jetting to dripping (tabella 4). Successivamente è stato eseguito un test con reagenti polimerici (PEG-MAL e crosslinker) per valutare la potenzialità dei chip nel generare capsule di polimero. Entrambi gli Optimized Needle chip generano capsule polimeriche con diametri diversi a seconda del set di portate imposte. In particolare l’incremento della portata della fase acqua ha un effetto maggiore sul diametro delle capsule rispetto all’aumento della portata della fase olio (figura 3). Figura 3. Diagramma che mostra la quantificazione della variazione del diametro delle capsule in funzione della portata imposta, analizzando le capsule dopo la collezione e purificazione. Un numero N>20 di capsule è stato misurato. Figura 4. Immagine che mostra il fenomeno del jetting to dripping con formazione di capsule polimeriche e capsule osservate al microscopio dopo il processo di purificazione. Il fenomeno del jetting to dripping avviene regolarmente con un’iniziale getto che si rompe formando gocce polimeriche sferiche. Inoltre le sfere post purificazione appaiono con una forma sferica ben definita (figura 4). I due chip ottimizzati sono stati testati infine utilizzando sferette di polistirene (PS) del diametro di 100 µm e MIN6 clusters. Figura 5. Diagramma che mostra la quantificazione della variazione del diametro delle capsule in funzione della portata imposta a) per i chip testati con sferette di polistirene, b) con chip testati con MIN6 clusters analizzando le capsule dopo la collezione e purificazione. Un numero N>20 di capsule è stato misurato. Nonostante il processo di formazione delle capsule polimeriche avvenga in maniera regolare appena al di sotto del canale centrale, sia le sferette di polistirene che i MIN6 clusters presentano un’elevata difficoltà a scorrere all’interno del chip ed essere incapsulati. Non si ha un flusso costante e regolare di sferette e clusters. Solo un numero molto ridotti di queste microparticelle fluisce nel chip e viene incapsulato. Discussioni e conclusioni Le due versioni ottimizzate del chip Needle non hanno mostrato significative differenze nel loro funzionamento. Entrambe sono in grado di generare gocce monodisperse in maniera controllata al variare del set di portate imposto. Il jetting to dripping, fenomeno alla base del conformal coating, appare ben definito con un iniziale getto che si rompe generando gocce di dimensioni micrometriche che vanno incontro a indurimento generando capsule di polimero sferiche. I limiti del funzionamento dei chip Needle ottimizzati riguardano il processo di incapsulamento di microparticelle quali sfere di polistirene e MIN6 clsuters. In particolare la difficoltà di ottenere un flusso regolare e constante di sfere o clusters rappresenta il principale ostacolo dei dispositivi testati. Nonostante la continua formazione di capsule di polimero, solo un numero molto ridotto di microparticelle fluisce all’interno del canale del chip e viene incapsulato. La geometria del chip e la nuova disposizione dei canali rispetto al Needle originale, impone dei bassi valori di portata della fase acqua per ottenere il jetting to dripping. Le sfere o MIN6 cluster, essendo sospesi nella fase acqua, sono soggetti alle stesse portate, i cui valori molto bassi sono insufficienti per promuovere un flusso continuo e costante di microparticelle e promuovere il loro movimento lungo i canali. Pertanto quest’ultime rimango bloccate all’interno del tubo accumulandosi fra di loro. Il parziale disallineamento dei due strati che compongono un chip è un altro fattore che può influenzare, in piccola parte, il processo di incapsulamento. L’allineamento manuale sotto lo stereomicroscopio induce inevitabilmente un errore, considerando che le dimensioni del chip sono nell’ordine dei micrometri. Tale errore di traduce in una variazione della sezione di passaggio del fluido che influenza a sua volta la velocità delle due fasi favorendo inoltre la formazione di bolle d’aria. Il chip originale Needle, da cui sono state ottenute le due versioni ottimizzate testate nel presente studio, rappresenta un’innovazione basata sulla presenza di una regione centrale di incapsulamento caratterizzata da una geometria di focusing del flusso. I risultati ottenuti hanno mostrato un’ottima capacità del dispositivo di incapsulare microparticelle, anche in modo conforme, in gocce polimeriche monodisperse. Tuttavia il metodo di iniezione simultaneo delle componenti della fase acqua, PEG-MAL e crosslinker, in un unico inlet forza il mantenimento del Ph a un valore basso, evitando l’istantanea gelazione ma causando sofferenza alle cellule. Le due versioni ottimizzati di questo Needle chip sono state progettate per poter iniettare separatamente PEG-MAL e crosslinker mantenendo i Ph dei due componenti a dei valori diversi in modo da favorire le cellule ed evitando un’ istantanea gelazione. Nonostante questa modifica rappresenti un punto importante per il miglioramento di questi dispositivi soft litografici per l’incapsulamento di cellule pancreatiche, i due chip Needle ottimizzati non hanno mostrato gli stessi risultati in termini di incapsulamento e conformal coating come il loro predecessore suggerendo una modifica geometrica e una nuova disposizione dei canali al fine di ottenere un processo di incapsulamento regolare e costante.