Micro-bubble electrospinning : sviluppo di un sistema di filatura delle proteine e applicazione alla rigenerazione del SNP

Introduction Peripheral nerve injuries are a significant clinical problem that affects the lives of patients on a global scale and as such are a major cause of disability. It can impair the ability to move muscles, perceive common sensations and can lead to painful neuropathies. The peripheral nervous system (PNS) has an intrinsic regenerative capacity if the compression or transection of the axons has not compromised the endoneurium and the cellular bodies of neurons, and if the distance between the axonal ends is less than 3/5 mm. Otherwise the lesion is to consider irreversible and would necessitate an external operation. In the case of extensive lesions, the therapies currently used to reactivate the functionalities are: surgical intervention to reconnect the stumps, the use of nerve guidance conduits (NGC), which promote the correct growth and alignment of nerve fibres by isolating and protecting the damaged area, and autograft. The latter being the current gold standard in treatments, however, it has exhibited some drawbacks. These include limited donor sources, the formation of neuromas at the donor site and multiple surgical sites [3]. Thus, large gaps need alternative clinical solutions to autologous approaches. NGC is of particular interest in tissue engineering, notably in their development from simple tubular structures, providing a protective space for nerve regeneration, to a device that seeks to promote neuronal outgrowth and accelerate axonal regeneration, including for gaps larger than 3 cm. This can be achieved through their functionalization. For example by providing intraluminal guidance features: some studies have introduced aligned fibres mimicking the endoneurial-like structure of autologous nerve grafts and physically directing Schwann cells (SC) migration and axonal regeneration to the distal target. Electrospinning is an excellent solution for the realization of these devices. Unlike other manufacturing techniques, it is able to obtain nanofibrous scaffolds. These are characterized by their high surface/volume ratio, high values of tunable porosity and different types of pattern, including the aligned one. This nanostructured topography is an accomplished biomimetic solution, which promotes better cell adhesion, proliferation and migration. However, the traditional system has limitations related to the needle use, including the solution gelation for natural material inside the spinneret and the resulting inhibition of the electrospinning process: only low viscosity solutions are therefore electrospinnable. Furthermore, productivity is lower. To solve these problems, needleless electrospinning techniques have been developed, using alternative spinneret with different geometry and working principles. They allow the electrospinnability of solutions with high viscosity and polymers with crystalline or complex structures, such as proteins, particularly interesting for the fabrication of scaffolds since they increase the biocompatibility. Bubble electrospinning is one of them: applying an electrostatic field, it generates nanofibres from air bubbles produced on the free surface of a polymeric solution. This brings many advantages: decreasing the bubble size (∼ 1 cm) the solution surface tension and the electric field are reduced, as well as energy consumption, while productivity and fibre size control are increased, lastly the electrospinnable polymer solutions include higher viscosity values and the presence of crystalline structures or colloidal substances. In fact, from the literature it emerged that this technique allowed the electrospinning of PVDF, a polymer characterized by a crystalline phase. The main goal of this thesis is to devise and design the micro-bubble electrospinning system, to improve polymers processing, such as fibrinogen, and reduce the working volumes. Later, to produce aligned nanofibrous fillers for NGC intraluminal guidance to improve peripheral nerve regeneration. Materials and methods Gelatin type A and fibrinogen are two natural polymers of particular interest for tissue engineering. The first one is extracted from collagen, the most abundant protein in SNP ECM, in comparison to which gelatin shows a better biodegradability and does not induce immune rejection problems. The second is one of the most abundant glycoprotein in blood plasma, which promotes cellular interactions and scaffolds remodeling. Furthermore, in case of nervous lesion and implantation of a tubular guide, the matrix secreted inside it and on which the Schwann cells migrate is constituted by fibrin. In this thesis the solutions used to produce electrospun matrixes are three types: gelatin A in acetic acid and water 9: 1, fibrinogen and blend of gelatin A and fibrinogen in formic acid and acetic acid 60:40. The electrospinning micro-bubble system has been designed and built for the production of electrospun scaffold, and it includes: Flow-meter for adjustable air flow; Polyurethane tube to connect the flow-meter to the needle; Non-pungent metal needle to blow compressed air and induce electric charge in the polymer solution; Reservoir containing the air-blown polymer solution; Refill system: syringe pump, PTFE capillary and metal spinneret (wedged in the reservoir) to provide new solution into the reservoir; High voltage generators (20 kV). Two types of collectors were used: a rectangular planar for the production of random fibres and a rotating cylindrical for aligned fibres (up to 2500 rpm), respectively supported by PS and PVC structures. To develop the micro-bubble electrospinning technique, a preliminary optimization was carried out using PEO in water and the solution and process parameters selected for the traditional system. The optimization permitted the correct choice of voltage ranges, reservoir-collector distance and polymer concentration and also a suitable reservoir size. The materials of interest were used to study the influence of the voltage, the reservoir-collector distance and the polymer concentration on the homogeneity of the electrospun matrixes, on the formation of defects and on the fibre diameter variation. Furthermore, a refill system was implemented in both experimental set-ups, to allow a continuous electrospinning process for several consecutive hours. It allow to maintain a constant volume and an adequate viscosity of the polymer solution inside the reservoir. The spinneret position in the reservoir, the refill speed and the concentration of the solution in the reservoir (Cr) and in the syringe (Cs) were determined to achieve these specifications. Lastly, an experiment was conduct on the influence of the cylindrical collector rotation speed (500 ÷ 2000 rpm) on the alignment degree and on the fibre diameter variation within the different materials. Utilising macroscopic analysis and electron microscopy, the optimal parameters for the production of consistent nanofibrous matrixes, dimensionally homogeneous, defect-free and with uniform cylindrical random or highly aligned fibres were identified. Using these parameters, electrospun matrixes made of gelatin, fibrinogen and a blend of the two materials were produced and characterized by SEM analysis. To increase their resistance in aqueous environment, the acetonitrile-EDC/NHS cross-linking method was used (ratio equal to 2,5; 50 mM). To assess its efficacy, preliminary stability tests in water were carried out at room temperature for 4 hours using gelatin matrixes. Furthermore, for all three materials of interest a degradation test in PBS at 37 ° C was carried out with time points of 1, 2, 7, 14 and 21 days. The degradation test allowed a quantitative analysis of the weight loss over time of the samples and a qualitative analysis of the fibres under an electronic microscope. For fibrinogen it was decided to conduct PBS degradation tests both with and without cross-linking, as this material is already water-insoluble after the electrospinning process. It was therefore decided to evaluate whether EDC/NHS cross-linking improved its water stability. Following the MBE’s optimization and matrixes characterizations, a comparison experiment between the MBE and the traditional one (TE) was carried out. Electrospun deposits of gelatin and fibrinogen, with both random and aligned fibre, were produced using the parameters optimized for each system. The quality of electrospun matrixes was evaluated, in terms of morphology, homogeneity and degree of alignment of nanofibres, to highlight a possible improvement due to the needle replacement in MBE set-up, as well as a productivity quantification of the process. Finally, a biological characterization of MB electrospun matrixes was made: Schwann cells were used as the cellular model as they play a fundamental role during nerve regeneration. The RT4-D6P2T cell line was chosen as this is a preliminary study. Adhesion tests at 4 and 24 hours were conducted on the random matrixes, while both a proliferation and a immunocytochemistry test at 1, 3 and 6 days were conducted on both patterns. Cell viability data were obtained through the Alamar Blue assay, while the influence of scaffold different superficial topography on cell morphology was evaluated through immunohistochemical staining and a fluorescence microscope. Results and discussion Following the MBE preliminary optimization through PEO, it was verified that the system worked correctly with concentrations of the polymeric solution similar to those defined for the traditional system (around 12.5% w/v): in fact, with lower concentrations a qualitative decrease of bubble thickness was observed. It caused a surface tension increase, that reduced the formation of jets, and electrospraying phenomenon. Furthermore, by increasing the reservoir diameter, inadequate and irregular fibrous matrixes are obtained. This is probably due to the generation of repulsive electrostatic forces between the free-surface solution charges and charges on the bubble summit. In fact, using the bigger reservoir, the bubble was smaller than those produced in reservoirs with lower diameter. For this reason, an intermediate sized reservoir was chosen. Using the materials of interest, an in-depth study was carried out. It focused on the influence of solution and electrospinning parameters on the macroscopic matrixes, and on the morphology and diameter of fibres. The results obtained and the phenomena observed agreed with what is already known of the traditional system in literature and from previous thesis. Following the MBE process optimization phase, the useful parameters for a homogeneous and defect-free production of electrospun matrixes were identified. Following the refill system optimization, the spinneret position in the reservoir was chosen in order to allow the mixing of the solution. The solution concentration values and the refill speed (Qv) were also defined. The cylindrical rotating collector set-up showed a high efficiency in electrospun fibre alignment, without affecting their size. An optimal rotation speed was selected for each material in order to obtain highly oriented matrixes, with excellent results for gelatin. Through electron microscopy it was confirmed that the acetonitrile-EDC/NHS cross-linking method does not alter the matrixes structure and the nanofibrous morphology and it succeeded in stabilizing them in an aqueous environment. The degradation tests in PBS at 37 ° C, instead, showed the maintenance of the nanostructured topography up to the seventh day for all the tested materials, 21 for the gelatin. In fact, this was the most stable material also in terms of weight variation (Figure 2). This analysis also allowed to quantitatively highlight the improvement in fibrinogen properties: without cross-linking treatment it showed poor water stability and fibres swelling already by the second time point. On the other hand, EDC treatment has significantly increased its stability over time, seeing as intact samples were still evident at the 21st day. The blend showed intermediate characteristics of the two pure materials. In addition to this, it has been noted that an increase in fibrinogen percentage, compared to gelatin, decreases its mechanical properties [19]. The comparison experiment between micro-bubble electrospinning and the traditional electrospinning has confirmed that the needleless strategy increases the process productivity: for aligned matrixes of gelatin and fibrinogen an increase of 18% and 36% has been registered respectively, compared to TE. In addition, a greater alignment degree was obtained utilizing the alternative system, particularly successful for gelatin. However, the most notable result of this experiment was the improvement in electrospinning process for materials with a more complex polymeric structure and high viscosity, such as fibrinogen. The micro-bubble electrospinning has allowed for more uniform and consistent cylindrical fibers to be obtained and has reduced the beads formation by approximately 10%, compared to the traditional system. Through quantitative morphological characterization, average fibre diameter resulted higher for MBE: this is presumably due to the higher voltage needed for this technique compared to TE, as observed in literature, or to the larger bubble size compared to that of the polymer drop at the end of the needle. It has been shown that varying this last parameter it is possible to tune the fibre diameter: this is a further advantage of bubble electrospinning technique, not withstanding that the bubble size accurate control is limited. From the in vitro biological characterization of the MBE electrospun matrixes it emerged that the RT4-D6P2T Schwann cells tend to better adhere and proliferate on fibrinogen-containing scaffolds, in particular on matrixes made with the fibrinogen and gelatin blend. Fibrinogen presence confers a protein composition, an RGD motifs quantity and distribution, a secondary structure and a substrate stiffness that induces more efficient proliferative signals than pure gelatin. In particular the cellular metabolic activity values, obtained from the proliferation test, were higher for the oriented substrates compared to the random ones. Moreover, Schwann cells assumed different cell morphologies based on scaffold topography already after the first day of culture. With random fibres extended cellular spreading was observed, while on aligned fibres a bipolar elongation and a cellular bands organization. These results have been found also in the literature and they confirm that the substrate topography plays a fundamental role on cellular behavior in terms of adhesion, proliferation and migration. Conclusions The micro-bubble system allowed the electrospinning of proteins such as gelatin and fibrinogen, overcoming the main difficulties related to the needle. The nanometric fibres show a uniform cylindrical morphology, a defect-free homogeneous distribution and a greater consistency. Furthermore, it was possible to demonstrate a better fibre alignment, higher productivity levels and the possibility to use small volumes of polymer solution. The micro-bubble electrospinning is therefore a valid alternative to needle electrospinning and existing needleless technologies, considering that it only requires a polymer bath and a blown gas. Following the in vitro biological characterization it emerged that the MBE electrospun matrices promote good cell adhesion and proliferation. Moreover they demonstrated their efficiency in contact guidance by inducing different Schwann cell morphologies with distinctive surface topography. In particular it emerged that the oriented blend scaffolds induce a greater metabolic activity and a better alignment. They could therefore constitute effective fillers for NGC promoting nerve regeneration.

Introduzione Le lesioni dei nervi periferici sono un problema clinico globale che influisce in modo significativo sulla qualità della vita dei pazienti, essendo una delle principali fonti di disabilità. Esse compromettono la capacità di muovere i muscoli, di percepire le sensazioni comuni e possono portare a neuropatie dolorose. Il sistema nervoso periferico (SNP) possiede una capacità rigenerativa intrinseca nel caso in cui la compressione o la transezione degli assoni non abbia compromesso né l’endonervio né i corpi cellulari dei neuroni, e la distanza tra le estremità assonali sia minore di 3/5 mm. La lesione è detta altrimenti irreversibile ed è necessario un intervento esterno. In caso di lesioni estese, le terapie attualmente utilizzate per il ripristino delle funzionalità sono: la chirurgia di riconnessione dei monconi, l’utilizzo di guide per la rigenerazione nervosa, che favoriscono il corretto sviluppo e allineamento delle fibre nervose isolando e proteggendo la zona danneggiata, e l’autotrapianto, che rappresenta l’attuale gold standard. Quest’ultimo mostra tuttavia delle criticità, come la disponibilità limitata di tessuto nervoso autologo, la formazione di neuromi a livello del sito donatore e la necessità di un duplice intervento chirurgico, che spingono la ricerca verso lo studio di una valida alternativa. Nel campo dell’ingegneria dei tessuti è nato quindi l’interesse per i condotti di guida nervosa, e in particolare per il loro sviluppo da semplici strutture tubolari, capaci di fornire uno spazio protetto, a dispositivi in grado di stimolare e accelerare la rigenerazione assonale, anche per lacune nervose con estensioni maggiori di 3 cm. Ciò è possibile tramite la funzionalizzazione di tali strutture. Tra le varie opzioni vi è l’introduzione all’interno della guida di un riempitivo costituito da fibre allineate: queste imitano la struttura proteica della matrice extracellulare (ECM) dell’endonervio e guidano la migrazione delle cellule di Schwann (CS) e la ricrescita assonale verso il target distale. L’electrospinning rappresenta un’ottima soluzione per la realizzazione di questi dispositivi. Rispetto ad altre tecniche di fabbricazione, esso permette di ottenere tessuti nanofibrosi caratterizzati da un alto rapporto superficie/volume, alti valori di porosità regolabili e diversi tipi di configurazione, tra cui quella allineata. Questa topografia nanostrutturata risulta essere un’ottima soluzione biomimetica, che promuove una maggiore adesione, proliferazione e migrazione cellulare. Il sistema tradizionale presenta tuttavia dei limiti legati all’utilizzo di aghi, tra cui la gelificazione della soluzione all’interno dello spinneret per materiali naturali e la conseguente inibizione del processo di elettrofilatura: la gamma delle soluzioni elettrofilabili è quindi ridotta a bassi valori di viscosità. L’utilizzo degli aghi, inoltre, non permette di raggiungere alti valori di produttività. Sono quindi state sviluppate delle tecniche di electrospinning “needleless”, che per risolvere tali problematiche sostituiscono l’ago con spinneret di diversa natura e geometria. Esse permettono quindi l’elettrofilatura di soluzioni ad alta viscosità e polimeri con strutture cristalline o complesse, come le proteine, le quali risultano di particolare interesse per la fabbricazione di scaffold cellulari poiché ne aumentano la biocompatibilità. Una soluzione è il bubble electrospinning, che, applicando un campo elettrostatico, genera fibre nanometriche da bolle d’aria prodotte sulla superficie libera di una soluzione polimerica. Questa strategia comporta numerosi vantaggi: diminuendo la dimensione delle bolle (∼ 1 cm) si riduce la tensione superficiale della soluzione e il valore di campo elettrico, abbassando il consumo di energia e aumentando la produttività, si ha un maggiore controllo della dimensione delle fibre e delle soluzioni polimeriche utilizzabili, includendo valori di viscosità più elevati e la presenza di strutture cristalline o sostanze colloidali. Infatti, dalla letteratura è emerso che questa tecnica ha consentito l’elettrofilatura del PVDF, un polimero caratterizzato da una fase cristallina. In questo lavoro di tesi ci si è proposti di ideare e progettare il sistema di micro-bubble electrospinning (MBE), con lo scopo di migliorare l’elettrofilatura dei polimeri come il fibrinogeno e di ridurre i volumi di soluzione polimerica necessari al processo. Tramite questa tecnica si sono voluti realizzare riempitivi nanofibrosi allineati per condotti di guida nervosa volti al miglioramento della rigenerazione periferica. Materiali e metodi Tra i polimeri di origine naturale utilizzati nell’ingegneria dei tessuti, sono risultati particolarmente interessanti la gelatina A e il fibrinogeno. La prima è ottenuta dal collagene, la proteina del tessuto connettivo più abbondante nell’ECM del SNP, rispetto al quale presenta però una migliore biodegradabilità priva di successiva risposta immunitaria. Il secondo, invece, è una glicoproteina abbondantemente presente nel plasma sanguigno, che promuove le interazioni cellulari e il rimodellamento degli scaffold che costituisce. Inoltre, in caso di lesione nervosa e impianto di una guida tubolare, la matrice generata al suo interno su cui migrano le cellule di Schwann è costituita da fibrina. Le soluzioni utilizzate per la realizzazione di matrici elettrofilate in questo lavoro di tesi sono tre: gelatina A in acido acetico e acqua 9:1, fibrinogeno e blend di gelatina A e fibrinogeno in acido formico e acido acetico 60:40. Per la realizzazione degli elettrofilati è stato progettato e realizzato il sistema di micro-bubble electrospinning, che comprende: Flussimetro per un flusso d'aria regolabile; Tubo in poliuretano per connettere il flussimetro all’ago; Ago non tagliente metallico per insufflare l’aria compressa e indurre carica elettrica nella soluzione polimerica; Reservoir contenente la soluzione polimerica insufflata d’aria; Sistema di refill: pompa a siringa, capillare in PTFE e spinneret metallico (incastrato nel reservoir) per apportare nuova soluzione al reservoir; Generatori di tensione da 20 kV; Sono stati utilizzati due tipi di collettori: un collettore rettangolare piano per la produzione di fibre random e uno cilindrico rotante (fino a 2500 rpm) per quelle allineate, rispettivamente sostenuti da strutture in PS e PVC. Per lo sviluppo della tecnica del micro-bubble electrospinning è stata svolta un’ottimizzazione preliminare con PEO in acqua, partendo dai parametri di soluzione e di processo utilizzati per il sistema tradizionale: sono quindi stati scelti i range utili di differenza di potenziale, di distanza reservoir-collettore e di concentrazione polimerica e un’adeguata dimensione del reservoir. Per lo studio dell’influenza della differenza di potenziale, della distanza reservoir-collettore e della concentrazione polimerica sull’omogeneità dei depositi elettrofilati, sulla formazione di difetti e sulla variazione del diametro medio delle fibre sono stati utilizzati, invece, i materiali d’interesse. Inoltre, è stato implementato un sistema di refill a entrambi i set-up sperimentali, per consentire un processo di elettrofilatura continuo per più ore consecutive: esso mantiene un volume costante e un’adeguata viscosità della soluzione polimerica all’interno del reservoir. A tal fine è stata determinata la disposizione dello spinneret metallico nel reservoir, la velocità di refill e la concentrazione della soluzione all’interno del reservoir (Cr) e della siringa (Cs). Infine, utilizzando il collettore cilindrico rotante, è stato svolto uno studio sull’influenza della velocità di rotazione (500÷2000 rpm) sul grado di allineamento e sulla variazione del diametro medio delle fibre elettrofilate, confrontando i diversi materiali. Tramite analisi macroscopica e microscopia elettronica, sono stati individuati i parametri ottimali per la produzione di reticoli nanofibrosi consistenti, dimensionalmente omogenei, privi di difetti e con fibre cilindriche uniformi, random o altamente allineate. Sono quindi state realizzate delle matrici elettrofilate in gelatina, fibrinogeno e blend dei due materiali caratterizzate tramite analisi al SEM. Per aumentarne la resistenza in ambiente acquoso, è stato utilizzato il metodo di reticolazione tramite EDC/NHS (2,5) in acetonitrile (50 mM). Per valutarne l’efficacia sono state svolte prove preliminari di stabilità in acqua a temperatura ambiente per 4 ore dei reticoli di gelatina, e di degradazione in PBS a 37°C con time point 1, 2, 7, 14 e 21 giorni per tutti e tre i materiali d’interesse. Quest’ultima ha permesso un’analisi quantitativa della perdita di peso nel tempo dei campioni e un’analisi qualitativa delle fibre al microscopio elettronico. Per il fibrinogeno si è deciso di condurre prove di degradazione in PBS sia con fibrinogeno puro che reticolato: questo materiale infatti dopo il processo di elettrofilatura è già insolubile in acqua. Si è quindi voluto valutare se la reticolazione con EDC/NHS ne migliorasse la stabilità in ambiente acquoso. A seguito dell’ottimizzazione del MBE e delle caratterizzazioni riportate è stato svolto un esperimento di confronto tra il micro-bubble electrospinning e il tradizionale (ET). Sono stati prodotti depositi elettrofilati di gelatina e fibrinogeno, sia random che allineati, utilizzando i parametri ottimizzati per ciascun sistema: in particolare, è stata valutata la qualità dei depositi elettrofilati, in termini di morfologia, omogeneità e grado di allineamento dei reticoli nanofibrosi, per evidenziare un’eventuale miglioramento apportato dalla sostituzione dell’ago del set-up sperimentale con le bolle polimeriche, oltre a una quantificazione della produttività del processo. Infine si è proceduto con una caratterizzazione biologica degli elettrofilati con MBE: come modello cellulare sono state utilizzate cellule di Schwann, le quali hanno un ruolo fondamentale durante la rigenerazione nervosa. Essendo uno studio preliminare sono state scelte le cellule di linea RT4-D6P2T. Sono stati condotti test di adesione a 4 e 24 ore sui soli substrati random nei tre materiali, e test di proliferazione e immunocitochimica a 1, 3 e 6 giorni per entrambe le tipologie di matrici, random e allineate. Attraverso il saggio Alamar Blue sono ottenuti dati relativi alla vitalità cellulare, mentre tramite colorazione immunoistochimica e osservazione al microscopio ottico a fluorescenza è stata valutata l’influenza della diversa topografia superficiale degli scaffold sulla morfologia cellulare. Risultati e discussione A seguito dell’ottimizzazione preliminare del MBE tramite PEO è stato verificato il corretto funzionamento del sistema con concentrazioni della soluzione polimerica simili a quelle utilizzate per il sistema tradizionale (intorno al 12,5% p/v): con concentrazioni inferiori, infatti, è stata osservata una diminuzione qualitativa dello spessore della bolla che causa un aumento della tensione superficiale, riducendo la formazione di jet, e il fenomeno di electrospraying. Inoltre, aumentando il diametro del reservoir sono stati ottenuti depositi fibrosi scarsi e meno omogenei, probabilmente dovuti alla generazione di forze elettrostatiche repulsive tra la carica superficiale presente sull’area libera della soluzione e le bolle formatesi nel centro, di grandezza più piccola rispetto a quelle dei reservoir con diametro inferiore. Per questo motivo è stato scelto un reservoir di dimensioni intermedie. Utilizzando i materiali d’interesse è stato svolto uno studio approfondito dell’influenza dei parametri della soluzione e di processo dell’electrospinning sul deposito macroscopico, sulla morfologia e sul diametro medio delle fibre: i risultati ottenuti e i fenomeni osservati sono risultati concordi con quanto noto in letteratura per il sistema tradizionale e da lavori di tesi precedenti. A seguito della fase di ottimizzazione del processo di MBE, sono stati individuati i parametri utili alla produzione di matrici elettrofilate omogenee e con reticoli nanofibrosi uniformi e privi di difetti. Dopo l’ottimizzazione del sistema di refill, è stata scelta la disposizione dello spinneret metallico nel reservoir, in modo da promuovere il rimescolamento della soluzione preesistente, le concentrazioni delle soluzioni e la velocità di refill (Qv). Il set-up con collettore cilindrico rotante ha mostrato un’alta efficienza nell’allineamento delle fibre elettrofilate, senza condizionare la dimensione delle fibre: per ciascun materiale è stata selezionata una velocità di rotazione ottimale all’ottenimento di matrici altamente orientate, con ottimi risultati per la gelatina. Tramite microscopia elettronica è stato confermato che il metodo di reticolazione tramite EDC/NHS non altera la struttura e la morfologia nanofibrosa delle matrici dopo il trattamento in acetonitrile e che stabilizza le matrici in ambiente acquoso. Le prove di degradazione in PBS a 37°C, invece, hanno permesso di osservare un mantenimento della topografia nanostrutturata fino al settimo giorno per tutti i materiali testati, 21 per la gelatina. Infatti, questa è risultata essere il materiale più stabile anche in termini di variazione di peso. Tale analisi ha permesso inoltre di evidenziare in modo quantitativo un miglioramento delle proprietà del fibrinogeno, il quale senza trattamento di reticolazione ha mostrato scarsa resistenza in ambiente acquoso e swelling delle fibre già al secondo time point. Il trattamento con EDC, invece, ne ha notevolmente aumentato la stabilità nel tempo, ottenendo campioni integri fino al ventunesimo giorno. Il blend assume, coerentemente, caratteristiche intermedie ai due materiali puri. In aggiunta a tale osservazione è stato studiato che un aumento della percentuale di fibrinogeno, rispetto alla gelatina, ne diminuisce le proprietà meccaniche. L’esperimento di confronto tra il micro-bubble electrospinning e il tradizionale ha confermato che la strategia needleless aumenta la produttività del processo: per le matrici allineate di gelatina e fibrinogeno è stato registrato infatti un incremento rispettivamente del 18% e del 36% rispetto all’ET, oltre a un maggiore grado di allineamento, particolarmente evidente per la gelatina. Il risultato più interessante del presente studio è, però, un miglioramento del processo di elettrofilatura per materiali con una struttura polimerica più complessa e ad alta viscosità, come il fibrinogeno. Il micro-bubble electrospinning ha consentito di ottenere fibre cilindriche più uniformi e consistenti e di ridurre il numero di beads del 10% circa rispetto al sistema tradizionale. Tramite caratterizzazione morfologica quantitativa sono stati calcolati valori di diametro medio delle fibre elettrofilate con MBE più alti rispetto all’ET, presumibilmente dovuti alla necessità di valori di differenza di potenziale maggiori, come osservato in letteratura, o alla dimensione delle bolle più grande rispetto alla goccia di polimero all’estremità dell’ago. È stato dimostrato che variando quest’ultimo parametro è possibile ottenere fibre con diametri differenti: ciò risulta essere un’ulteriore vantaggio della tecnica di bubble electrospinning, tenendo conto però che il controllo fine delle bolle risulta limitato. Dalla caratterizzazione biologica in vitro delle matrici elettrofilate con MBE è emerso che le cellule di Schwann RT4-D6P2T tendono ad aderire e proliferare meglio su scaffold contenenti il fibrinogeno, in particolare sul blend. La composizione proteica, la quantità e la distribuzione dei motivi RGD, la struttura secondaria e la rigidezza del substrato, dovuti alla presenza del fibrinogeno, potrebbero indurre segnali proliferativi più efficienti rispetto alla gelatina pura. In particolare è stato osservato che i valori di attività metabolica, ottenuti dal test di proliferazione cellulare, sono risultati più elevati per i substrati orientati rispetto a quelli random. Inoltre le cellule di Schwann hanno assunto morfologie cellulari diverse in base alla topografia dello scaffold già dopo il primo giorno di coltura. In presenza di fibre disposte casualmente è stato osservato uno spreading cellulare esteso, mentre su fibre allineate un allungamento bipolare e un’organizzazione in bande cellulari. Tali morfologie sono state riscontrate anche in letteratura, confermando che la topografia dei substrati gioca un ruolo fondamentale sul comportamento cellulare in termini di adesione, proliferazione e migrazione. Conclusioni Il micro-bubble electrospinning ha permesso l’elettrofilatura di proteine quali la gelatina e il fibrinogeno, superando le principali difficoltà relative all’ago. Le fibre nanometriche mostrano una morfologia cilindrica uniforme, una distribuzione omogenea priva di difetti e una maggiore consistenza. Inoltre è stato possibile dimostrare una migliore capacità di allineamento delle fibre, livelli di produttività più alti e la possibilità di utilizzo di piccoli volumi di soluzione polimerica. Il micro-bubble electrospinning risulta quindi essere una valida alternativa all’electrospinning con ago e alle tecnologie needleless già esistenti, considerando che necessita solamente un bagno di polimero e un gas insufflato. A seguito della caratterizzazione biologica in vitro è emerso che le matrici elettrofilate tramite MBE promuovono una buona adesione e proliferazione cellulare. Inoltre hanno dimostrato la loro efficienza nella contact guidance, inducendo le Schwann a morfologie cellulari distinte in base alla diversa topografia superficiale. In particolare è emerso che gli scaffold in blend orientati inducono una maggiore attività metabolica e un migliore allineamento. Essi potrebbero quindi costituire efficaci riempitivi per condotti di guida nervosa volti a promuovere la rigenerazione periferica.