Il principio delle 3R : dalla sperimentazione animale alla sperimentazione in vitro. Microtessuti ingegnerizzati per screening farmacologici

The number of animals used in research has increased with the advancement of research and development in medical technology. According to the European Commission statistics, every year 11,5 millions of animals are exploited in UE only. In this thesis work, the attention is focused on the 3R principle, Replacement, Reduction, Refinement, referred by Russel and Burch in 1959 firstly. Before employing animal testing, one must wonder if an in vitro model could be used instead (Replacement); one must then try to decrease the number of animals as much as possible (Reduction); finally the level of suffering of the animals must be minimized (Refinement). Nowadays the animal testing is the golden standard to test new drugs, other chemical substances and to evaluate the biocompatibility of the medical devices. To get an overview of the animal testing state of art one can look at the ISO 10993. This is a combination of numerous national and international standards concerning the biological evaluation of medical devices. In this work, the attention is to understand which among the animal testing can be realized with in vitro testing instead. The animal model is the golden standard to test new drugs since it provides a complex physiological structure similar to the human one. Nevertheless it doesn't accurately reflect the reality for humans, especially in terms of toxicity. For these reasons in vitro testing is emerging, in particular 3D cell culture systems to create hepatic microtissues for drug screening. 3D liver tissue engineering requires spatiotemporal distribution of soluble factors for hepatic differentiation of stem cells and long-term culture of hepatocytes. Besides, in the long-term culture in order to get a longer cells' viability and better hepatocytes specific functions, a dynamic culture has to be employed, such as continuous perfusion. Therefore microfluid devices, organs-on-chips, are fabricated. In the recent years, body-on-chips are been developed, namely platforms made by several integrated organs-on-chips for more advanced and accurate drug and therapeutic studies. As a result, these more capable 3D platforms have immense potential to influence the drug development pipeline, by decreasing development costs and increasing the success of drug candidates compounds in clinical trials. In the end, developments in tissue engineering will enable to use animals in research less and less, replacing them with in vitro microtissues, in accordance with the 3R principle.

Viste le numerose scoperte e gli sviluppi in ambito medico, si fa sempre più uso di animali per scopi sperimentali o per altri fini scientifici. Secondo le più recenti statistiche della Commissione Europea, ogni anno sono 11,5 milioni gli animali utilizzati a fini sperimentali. In questo lavoro di tesi si pone l'attenzione sul principio delle 3R, Replacement, Reduction, Refinement, definito da due accademici britannici, Russel e Burch nel 1959. Prima di iniziare la sperimentazione animale, occorre chiedersi se sia possibile sostituire il modello animale prescelto con altri modelli in vitro (Replacement); quindi si deve cercare di ridurre il più possibile il numero di individui utilizzati nel proprio protocollo sperimentale (Reduction); infine si deve minimizzare il più possibile il livello di sofferenza imposto agli animali sperimentali (Refinement). Attualmente, il modello animale è il “golden standard” per testare nuovi farmaci, vaccini, altre sostanze chimiche e per determinare la biocompatibilità di un nuovo prodotto medicale. Come stato dell'arte dei test sperimentali che vengono effettuati sugli animali si prende in considerazione la normativa ISO 10993, che è una combinazione di numerose norme internazionali e nazionali riguardanti la valutazione biologica dei dispositivi medici. Si cerca di comprendere quali dei test che vengono effettuati oggi sugli animali, secondo la normativa ISO 10993, è possibile trasferire in vitro. Anche se il modello animale è il “golden standard” per testare nuovi farmaci, non sempre risulta adeguato, specialmente per quanto riguarda i test tossicologici. Perciò, si cerca di porre maggiore attenzione sulla sperimentazione in vitro, in particolare sui sistemi di coltura cellulare 3D per realizzare dei microtessuti di fegato per effettuare così degli screening farmacologici. Si è osservato che, per garantire la differenziazione delle cellule staminali e la vitalità cellulare degli epatociti in colture in vitro a lungo tempo, è richiesta una distribuzione spazio-temporale di fattori solubili all'interno del medium di coltura ed è necessario una coltura dinamica, come ad esempio con una perfusione continua. Vengono perciò realizzati dei dispositivi microfluidici, organi su chip. Negli ultimi anni si sente parlare addirittura di body-on-chip, cioè vengono realizzate delle piattaforme costituite da più organi su chip integrati tra di loro, per rappresentare sempre in maniera più fedele la complessità dell'organismo umano. Dunque, utilizzando queste piattaforme di organi su chip, si avrà una diminuzione drastica dei costi per lanciare un nuovo farmaco sul mercato. Ci sarà una maggiore probabilità di successo del farmaco negli studi clinici e i fallimenti potranno essere osservati prima, nella fase preclinica. In conclusione, si può comprendere come grazie agli sviluppi nell'ingegneria dei tessuti e all'utilizzo di questi modelli di microtessuti realizzati in vitro, si farà un uso sempre più limitato di animali da laboratorio, in accordo con il principio delle 3R.