Injectable methylcellulose hydrogel for fetoscopic tracheal occlusion in congenital diaphragmatic hernia (CDH)

Introduction Congenital diaphragmatic hernia (CDH) is a pathological condition that develops during the first trimester of gestation, when the embryonic pleuroperitoneal membrane does not form correctly, an opening is generated between the chest and intestines, allowing the abdominal organs to protrude into the pleural cavity. This causes problems in the growth of the fetus, as abdominal organs can be misplaced in the chest. Other post-natal consequences are pulmonary hypoplasia (PH) and persistent pulmonary hypertension (PPH). The reported incidence of CDH is of 1 in 2,500 to 4,000 live births. Despite the improvements in diagnosis and medical therapies, in most severe cases the reported mortality from associated outcomes still reaches 60%. In cases with poor prognosis, fetal lung growth can be stimulated with prenatal tracheal occlusion (TO). Thanks to this obstruction, the physiological production of lung fluid from alveolar pneumocytes is argued to increase the pressure within the lower airways and push the organs back in the abdomen. Fetoscopic endoluminal tracheal occlusion (FETO) is a therapeutic option for most severe cases. TO is obtained with a detachable balloon, which is endoscopically positioned and inflated in the tracheal cavity at 26–28 weeks of gestation. Although this procedure is reported to provide an increment of survival rate, FETO is also invasive and has an increased risk for preterm delivery. Due to the several drawbacks, we evaluated the idea to substitute the balloon with a gel plug. The advantages of this solution are different: it is more flexible and adapts better to the tracheal shape. A gel plug would also degrade spontaneously or may be suctioned from airways, avoiding a second surgical intervention. In a previous study, two types of gel plug were developed: calcium alginate hydrogels and a hyaluronan-methylcellulose blend (HAMC). The former is an in situ gelling compound, while the latter was tested as a pre-formed gel. Between the two options, high viscosity HAMCs resulted on average more resistant, remaining stable up to 4 weeks and with promising results in term of mechanical properties. A further optimization was however needed for HAMCs to better understand the influence of HA in its blend with MC. This was the starting point of the present project, which then has developed in an in-depth analysis of pure methylcellulose hydrogels. MC is a water-soluble polymer with a propensity to form crosslinked three-dimensional network hydrogels that tends to swell in water or biological fluids. These polymers are capable of self-structuring upon temperature variation, exhibiting thermo-reversible sol-gel transition with a specific lower critical solution temperature (LCST). Hydrogels were tested in order to evaluate their suitability in term of mechanical properties, injectability and resistance to the internal flow pressures. The hydrogel behaviour over time was also assessed together with its shape variation after swelling. Furthermore, we investigated the possibility of sterilizing the pre-formed compounds. Finally, a biological evaluation was performed with an in vitro indirect cytotoxicity assay. Materials and Methods MC (4,000 mPas) solutions were developed by a dispersion technique in a PBS solution. Different concentrations of MC were tested: 8, 10, 12, 14 and 16 %w/v. HAMC blends were obtained with the same technique in ratios of 3:8, 4:8, 5:8, 5:7 and 3:9 HA:MC. A rheological characterization provided information about the material viscoelastic properties. Dynamic stress sweep was applied to the samples to identify their linear viscoelastic region (LVR), while dynamic frequency sweep defined their shear storage modulus (G’) and shear loss modulus (G’’), in a frequency range of 10 to 0.01 Hz. In order to test the hydrogels injectability and resistance to the physiological pressures applied at the implantation site, a trachea model was set-up. Biological trachea samples were positioned into a chamber, connected to two reservoirs. This system exerted a stationary pressure of 10 cmH2O over the considered tract. In order to simulate early Fetal Respiratory Movements, the reservoir on the bronchi side could reach pressures up to 80 cmH2O. The system was filled with a saline solution - artificial lung fluid (aLF) - that simulated the electrolytes composition of pulmonary fluid, prepared mixing NaCl 150 mM and KCl 6.3 mM diluted in deionized water and conditioned at 37 °C. Hydrogels were injected through a 12G needle and through a catheter with the characteristics of commercial uncuffed tracheal tubes. To test sealing endurance, a simplified model was used, constating in multiple parallel chambers that applied a stationary pressure of 10 cmH2O. Weight and volume changes were assessed during swelling, with aLF and sodium azide 0.02% at 37 °C as degradation medium. MCs were observed throughout a two-month period, while HAMCs were tested over a month. An evaluation of the effects of the sterilization process on the pre-formed compound was performed. Samples were autoclaved at 121 °C for 50 minutes. Once the sterilization cycle was over, hydrogels were placed at 4 °C to stabilize for 24 hours. Volume and weight changes were measured. Mechanical performances of autoclaved gels were tested with a rheological analysis. To study the hydrogel behaviour along with the tracheal development, an experimental model was designed, in collaboration with the research group of prof. Dellacà. The system that hosted the biological sample was provided with an adjustable wall that applied a suitable tension to it. An in vitro biological evaluation was finally performed on the MC hydrogels. An indirect cytotoxicity test was executed by incubating L929 murine fibroblasts with eluates, obtained from the incubation of culture medium with 200 µL of hydrogel for 7 days, 3 days and 24h. Cell viability was assessed with an Alamar Blue® assay. Statistical analysis was performed using Matlab software (MathWorks, version R2018b). Significant differences between two groups of data were determined by One-way ANOVA (one-way analysis of variance) and a value of p < 0.05 was considered statistically significant. Results Among all the tested MC concentrations, the 12 and 14 %w/v resulted as the most promising, combining suitable outcomes in term of mechanical properties, injectability and sealing properties. The rheological characterization confirmed the typical behaviour of entangled network, showing a predominant elastic character. An increase in the methylcellulose concentration, corresponded to an increase in mechanical properties of the resulting hydrogel. We demonstrated that the gel strength could be tuned through the adjustment of MC content. This tunability is observable also in the HAMC blends. Each blend was characterized by a pronounced solid-like behaviour. Moreover, an increase in the HA amount seemed to increase the viscosity of the resulting hydrogels, promoting their injectability. All the HAMC blends were in fact injectable through a 12G needle. All the MCs resulted injectable through the uncuffed tracheal tube. However, the most concentrated MCs (14 and 16 %w/v) were not injectable through the 12G needle. In relation to the maximum sealing pressure reached by hydrogels, plugs with lower MC concentrations (8 and 10 %w/v) did not reach the maximum value of pressure. Indeed, they started leaking at a medium pressure of 60 and 54 cmH2O, respectively. Only one of the three replicates of 12 and 14 %w/v MC hydrogels reached the maximum pressure of 80 cmH2O, whereas all the 16 %w/v MC samples resisted until the reservoir was full. These results confirmed the rheological outcome, showing an improvement of the hydraulic seal in MCs characterized by a higher polymer content. The same behaviour was noticeable from the sealing endurance results. MC 8 %w/v did not satisfy the sealing time requested for the plug application. The hydrogel leaked out from the system after few hours, so it was excluded from the options. MC 10 %w/v demonstrated a poor reliability as well. A higher MC content provided better sealing persistence (up to 2 months), showing a stable resistance to the stationary pressure of 10 cmH2O. The MCs stability was observable also during the swelling experiment. As expected, all the samples underwent an initial swelling, increasing their weight, throughout the entire first week. After reaching a maximum value that varied significantly with the MC concentration tested, hydrogels began to lose weight very slowly. The least concentrated samples (MC 8 %w/v) showed a faster weight loss around the sixth week. The amount and rate of hydrogels swelling were acceptable (peaks of 60 to 70% of the initial weight). From the preliminary observations of the shape variation over time, a continuous increase in the hydrogel height confirmed that the plug would grow together with the surrounding space. All the MCs withstood autoclaving, with an evident weight and volume loss. The mechanical properties varied as well after autoclaving. Finally, the indirect cytotoxicity test showed a cell viability higher than 70%, for all time points. According to the ISO 10993-5 standard, these results indicate that no cytotoxic effect was caused by the release of toxic substances from the methylcellulose samples. Conclusions In general, the methylcellulose hydrogels responded positively to the requirements established in this study. The material stability and biocompatibility had demonstrated to be suitable with the characteristics that the implanted device must provide. MC 12 and 14 %w/v were preferred to the MC 10 %w/v because of their better mechanical performances, sealing properties and controlled swelling ratio. The lowest and highest concentrations were excluded because of the MC 8 %w/v poor sealing capacities, and the difficulties observed during the MC 16 %w/v preparation and injection. Finally, the promising results achieved with the indirect cytotoxicity assay proved the material compatibility.

Introduzione L’ernia diaframmatica congenita (CDH) è una condizione patologica che si sviluppa durante il primo trimestre di gestazione. Quando la membrana pleuroperitoneale embrionale non si forma correttamente, si viene a generare un’apertura tra il torace e l’addome, consentendo agli organi addominali di invadere la cavità pleurica. Questa condizione genera complicazioni in termini di sviluppo del feto, in quanto gli organi sono mal posizionati nel torace. Altre conseguenze comprendono l’ipoplasia polmonare (PH) e l’ipertensione polmonare persistente (PPH). L’incidenza della CDH è di 1 su 2.500 fino a 4.000 nascite. Nonostante i progressi fatti nel campo della diagnosi e delle terapie mediche, la mortalità riportata, nei casi più gravi, raggiunge il 60%. Per questi, è possibile favorire la crescita dei polmoni tramite occlusione della trachea del feto (TO). Grazie a questa ostruzione, la produzione fisiologica di fluido polmonare, proveniente dagli pneumociti alveolari, porta ad un incremento della pressione all’interno delle vie aeree inferiori, che spinge gli organi nella cavità addominale. La tecnica FETO (Fetoscopic endoluminal tracheal occlusion) è una pratica clinica riconosciuta per ostruire la trachea fetale. Consiste nell’applicazione di un palloncino removibile, che viene posizionato e gonfiato tramite endoscopia all’interno della trachea, tra la 26esima e 28esima settimana di gestazione. Sebbene questa procedura comporti un incremento del tasso di sopravvivenza, la FETO risulta comunque rischiosa, con un alto tasso di fallimento. Pertanto, è stata presa in considerazione la possibilità di sostituire il palloncino con un gel. I vantaggi di questa alternativa sono molteplici: il gel è più flessibile, adattandosi meglio alla forma della trachea, si degrada spontaneamente nel tempo o può eventualmente essere aspirato dalle vie aeree, evitando un secondo intervento chirurgico. In uno studio precedente sono stati valutati due materiali: idrogeli di alginato di calcio e blend di metilcellulosa e acido ialuronico (HAMC). Il primo è un composto che gelifica in situ, mentre il secondo è stato testato come idrogelo iniettabile già in forma di gel. Tra le opzioni proposte, i blend di HAMC risultano in media più resistenti, rimanendo stabili per 4 settimane e con risultati promettenti in termini di proprietà meccaniche. Un’ulteriore ottimizzazione del materiale risulta comunque necessaria per approfondire l’influenza del HA all’interno del blend. Questo aspetto è stato il punto di partenza dell’elaborato, che si è successivamente focalizzato sull’analisi di idrogeli di metilcellulosa pura. La MC è un polimero solubile in acqua in grado di formare idrogeli (reti tridimensionali) che si rigonfiano a contatto con I fluidi biologici. Questi polimeri mostrano un comportamento termo-reversibile e sono caratterizzati da una temperatura di transizione specifica (lower critical solution temperature, LCST). Gli idrogeli sono stati testati testate in termini di proprietà Meccaniche, iniettabilità e resistenza alle pressioni fisiologiche. La loro stabilità nel tempo e il loro cambio di forma dato dal rigonfiamento, sono stati valutati sperimentalmente. Inoltre, è stata indagata la possibilità di sterilizzare direttamente i composti preformati. Infine, è stata effettuata una caratterizzazione biologica in vitro. Materiali e Metodi Le soluzioni di MC (4,000 mPas) sono state preparate mediante una tecnica di dispersione in una soluzione di PBS. Sono state testate diverse concentrazioni: 8, 10, 12, 14 and 16 %w/v, rispettivamente. Il blend di HAMC è stato ottenuto mediante la stessa tecnica, in rapporti di 3:8, 4:8, 5:8, 5:7 and 3:9 HA:MC. La caratterizzazione reologica ha fornito informazioni circa le proprietà viscoelastiche dei materiali. Ai campioni è stato applicato uno stress sweep dinamico per identificarne la regione lineare viscoelastica (LVR), mentre il frequency sweep dinamico ne ha definito il modulo conservativo (G’) e dissipativo (G’’), in un range di frequenza variabile tra 10 e 0.01 Hz. Per testare l’iniettabilità degli idrogeli e la resistenza alla pressione fisiologica presente nel sito di impianto, è stato realizzato un modello sperimentale della cavità tracheale. Dei campioni biologici di trachea non fissati (provenienti da polli), sono stati posizionati in una camera, connessa a due serbatoi. Questo sistema esercita una pressione stazionaria di 10 cmH2O nel tratto considerato. Per simulare i movimenti respiratori del feto, il serbatoio dal lato dei bronchi è in grado di raggiungere pressioni fino a 80 cmH2O. Il sistema viene riempito con una soluzione salina - artificial lung fluid (aLF) – che simula la composizione elettrolitica del liquido pleurico, realizzata miscelando NaCl 150 mM e KCl 6.3 mM diluiti in acqua demineralizzata e precondizionata a 37 °C. Gli idrogeli sono stati iniettati tramite un ago da 12G e attraverso un catetere con le specifiche dei tubi endotracheali commerciali. Per testare le proprietà di tenuta nel tempo, è stata utilizzata una versione semplificata del modello. Questo consiste in più camere in parallelo, sottoposte ad una pressione stazionaria pari a 10 cmH2O. Variazioni di peso e volume sono state valutate durante il rigonfiamento dell’idrogelo, con aLF e sodio azide 0.02% a 37 °C come mezzo di degradazione. Le MC sono state valutate su un periodo di due mesi, mentre le HAMCs su un periodo di un mese. Si è proceduto ad una valutazione degli effetti del metodo di sterilizzazione applicato direttamente ai composti preformati. I campioni sono stati posti in autoclave a 121 °C per 50 min. Una volta terminato il ciclo di sterilizzazione, gli idrogeli sono stati messi a stabilizzare a 4 °C per 24 ore. Sono state misurate eventuali variazioni di peso e volume, mentre le caratteristiche meccaniche sono state analizzate tramite reologie. Per studiare il comportamento degli idrogeli, una volta sottoposti ad una crescita del tratto tracheale, è stato sviluppato un modello sperimentale in collaborazione con il gruppo di ricerca del prof. Dellacà. La camera in cui viene posto il campione biologico è dotata di una parete mobile, in grado di applicare una tensione al campione. Infine, è stata effettuata una valutazione biologica sugli idrogeli in vitro. È stata eseguita una prova di citotossicità indiretta, incubando fibroblasti L929 con gli eluati ottenuti mettendo a contatto il mezzo di coltura con 200 µL di gel per 7, 3 giorni e 24 ore, rispettivamente. La vitalità cellulare è stata determinata mediante un saggio Alamar Blue®. Risultati Tra le concentrazioni di MC testate, la 12 e la 14 %w/v risultano le più promettenti, in grado di combinare adeguate proprietà meccaniche, iniettabilità e resistenza a pressione. La caratterizzazione reologica ha confermato il tipico comportamento di network tridimensionali, mostrando un carattere elastico predominante. Un aumento nella concentrazione di MC corrisponde ad un aumento delle proprietà meccaniche del gel risultante. Si è dimostrato che la forza del gel è regolabile attraverso una corrispondente modifica del contenuto di MC. Questo fenomeno è osservabile anche nei blend di HAMC. Ogni blend mostra un evidente comportamento solid-like. Inoltre, un aumento di HA all’interno del composto, sembra aumentare la viscosità complessa degli idrogeli, promuovendone l’iniettabilità. Tutti gli HAMC testati sono infatti iniettabili attraverso un ago da 12G. Tutti i gel di metilcellulosa pura risultano iniettabili attraverso il catetere. Le concentrazioni di MC più elevate (14 e 16 %w/v) invece, non risultano iniettabili attraverso l’ago da 12G. Le concentrazioni di MC più basse (8 e 10 %w/v) non raggiungono il massimo valore di pressione. Iniziano a perdere tenuta idraulica ad una pressione media di 60 e 54 cmH2O, rispettivamente. Soltanto uno dei tre replicati della 12 e 14 %w/v MC ha raggiunto la massima pressione di 80 cmH2O, mentre tutti i campioni della 16 %w/v MC hanno resistito fino al completo riempimento del reservoir. Questi risultati sono in accordo con le reologie, infatti un aumento nella quantità di polimero corrisponde ad un miglioramento nella rispettiva tenuta idraulica. Complessivamente, il comportamento descritto si osserva anche nelle prove di resistenza nel tempo. La MC 8 %w/v non soddisfa il tempo richiesto per dall’applicazione. La funzione di plug viene infatti persa poche ore dopo l’inizio della prova, eliminando questa concentrazione dalle possibili alternative. Anche la MC 10 %w/v ha mostrato una bassa affidabilità. Di nuovo, una maggiore concentrazione di MC offre una migliore resistenza idraulica ad una pressione stazionaria di 10 cmH2O (fino a 2 mesi). La stabilità degli idrogeli di MC si osserva anche nelle prove di swelling. Tutti i campioni rigonfiano in un primo momento, aumentando in peso durante la prima settimana. Dopo aver raggiunto un picco, il cui valore varia significativamente con la concentrazione di MC testata, gli idrogeli iniziano a perdere peso molto lentamente. I campioni meno concentrati mostrano una perdita di peso più consistente, intorno alla sesta settimana di misure. I valori registrati sono accettabili (picchi di 60-70% del peso iniziale). Dalle osservazioni sulla variazione di forma nel tempo, l’aumento del gel in lunghezza conferma che il plug crescerà insieme alla trachea nel periodo dell’impianto, adattandosi allo spazio circostante. Tutti i campioni di MC hanno resistito alla sterilizzazione in autoclave, con evidente perdita di peso e volume. Anche le proprietà meccaniche hanno subito una variazione notevole. Infine, il test di citotossicità indiretta ha riportato una vitalità cellulare superiore al 70%, confermando l’assenza di effetti citotossici da parte dei campioni di metilcellulosa. Conclusioni Complessivamente, gli idrogeli di metilcellulosa hanno dimostrato la propria adeguatezza ai requisiti imposti, rispondendo positivamente ad ognuno di essi. La stabilità e biocompatibilità del materiale sono caratteristiche indispensabili al fine di ottenere un adeguato dispositivo impiantabile. Le concentrazioni pari a 12 e 14 %w/v sono state predilette rispetto alle altre sperimentate, in quanto hanno dimostrato di essere il migliore compromesso in termini di proprietà meccaniche, di resistenza a pressioni fisiologiche e con una variazione controllata di peso e volume durante il rigonfiamento. I risultati promettenti ottenuti con il test di citotossicità indiretta hanno confermato la compatibilità del materiale.