Vascularization of a scaffold made by hydrogel through a hydro-soluble vascular network obtained with a 3D FDM printer

The regenerative medicine goal is to be an alternative to transplantations and prosthesis in order to regenerate damaged or diseased tissues which means to recover their continuity and functionality. Tissue engineering is a combination of all the elements utilized in regenerative medicine: cells, scaffold and signals; its aim is to generate tissues in vitro utilizing cells of the patient, which then will be used as substitutes for damaged or diseased tissues. The main limitation of tissue engineering is the vascularization because cells need to be provided with oxygen and nutrients to perform their physiological activities but also it is necessary to remove their wastes such as carbon dioxide. Until now has not been found an adequate solution to vascularize properly the structures which support cells in 3D cultures that are utilized in tissue engineering, but several works were performed following this target; the present work analyzes the most important of them, focusing on the ones which utilize the 3D printing methods. The aim of the present thesis work is to obtain a vascularized scaffold in which cells receive an adequate amount of oxygen and nutrients following the consideration that in nature each capillary is situated at a distance of approximately 200 µm from another one; for this purpose it was utilized a 3D FDM printer to print a hydro-soluble vascular network. It was designed a procedure to obtain a vascularized hydrogel and a vascular network on multiple planes with channels distant 200 µm from one to another; in this way, at least in the central zone, cells receive an adequate amount of oxygen and nutrients. Analytic calculations and a computational analysis through the software Ansys Fluent, were performed to define the velocity at which it is possible to perfuse the vascular network designed. The procedure, to obtain the vascular network designed, requests a 3D printer with two extruders, but the one available in LaBS (Laboratory of Biological Structures) posses only one extruder and so, it was printed a vascular network with only one plane of the originally designed one. The vascular network is printed in polyvinyl alcohol (PVA), which is a hydro-soluble material, then it is placed in a scaffold mold made by silicone rubber (Silplay 184/28) and embedded in a hydrogel solution (composed by: 50% of gelatin and 50% of alginate) and once this last one pass from sol to gel state, the vascular network removal is performed through active perfusion with deionized water. The silicone scaffold mold was produced from a master obtained with the combination of two pieces printed in acrylonitrile-butadiene-styrene (ABS) through a 3D FDM printer. It were also designed a cap and a base to seal the silicone scaffold mold in order to prevent bacterial contamination for its possible future utilize with cell-laden hydrogels, these parts were printed in polylactic acid (PLA) and post-processed to form through holes and threaded holes in order to allow to seal them, assembling the final device through the tightening of four screws. The final device was connected to an hydraulic circuit to remove the PVA vascular network through the active perfusion with deionized water . The times request for the complete removal of PVA were too long (more than 7 hours), this can compromise cells viability when dealing with cell-laden hydrogels, but it is possible to change the kind of hydrogel or its reticulation method in order to reduce them. Furthermore the channels diameter obtained into the hydrogel is in the range of small arteries and not in the one of capillaries, but they can be reduced using a 3D printer with better performances and reducing the time requested for vascular network complete removal from the hydrogel. Furthermore the channels diameters in the obtained vascularized scaffold were bigger than the ones of vascular network printed, this is due to the fact that PVA absorb water when it is embedded into the hydrogel and during the active perfusion. Thus it is necessary to consider this phenomenon during the design of successive vascular networks to utilize in order to vascularize scaffolds following this procedure. The present thesis work represent a forward step in the scaffold vascularization because it confirms the possibility to use an economic procedure, recently developed to vascularize scaffolds. In the successive studies it must be necessary try to obtain the vascular network on multiple planes into the same or a better hydrogel to confirm the versatility of the procedure, which can be applied to different kind of vascular networks and, once it is obtained, perform the same procedure with cells to collect data on the real possibility to obtain vascularized engineered constructs through this procedure.

L'obbiettivo della medicina rigenerativa è quello di essere un'alternativa ai trapianti e alle protesi per rigenerare tessuti danneggiati o malati che significa ripristinarne la continuità e funzionalità. L'ingegneria dei tessuti è una combinazione di tutti gli elementi utilizzati in medicina rigenerativa: cellule, scaffold e segnali; il suo scopo è quello di generare tessuti in vitro utilizzando le cellule del paziente, questi poi saranno utilizzati come sostituti per tessuti danneggiati o malati. La principale limitazione dell'ingegneria dei tessuti è la vascolarizzazione, perché le cellule necessitano di essere rifornite con ossigeno e nutrimenti per poter svolgere le loro attività fisiologiche ma è anche necessario rimuovere i loro prodotti di rifiuto come il diossido di carbonio. Fino ad ora non è stata ancora trovata un'adeguata soluzione per vascolarizzare propriamente le strutture che supportano le cellule e che sono utilizzate in ingegneria dei tessuti, ma diversi lavori sono stati effettuati seguendo questo obbiettivo; il presente lavoro analizza i più importanti, focalizzandosi su quelli che utilizzano i metodi di stampa 3D. Lo scopo del presente lavoro di tesi è di ottenere uno scaffold vascolarizzato in cui le cellule ricevono un'adeguata quantità di ossigeno e nutrimenti seguendo la considerazione che in natura ogni capillare è situato ad una distanza di 200 µm da un altro; per questo scopo è stata utilizzata una stampante 3D FDM per stampare una rete vascolare idrosolubile. E' stata progettata una procedura per ottenere un idrogelo vascolarizzato e una rete vascolare avente piani multipli e con canali distanti 200 µm l'uno dall'altro; in questo modo, almeno nella zona centrale, le cellule ricevono un'adeguata quantità di ossigeno e nutrimenti. Sono stati effettuati calcoli analitici e un'analisi computazionale con il software Ansys Fluent, per definire la velocità alla quale è possibile perfondere la rete vascolare progettata. La procedura, per ottenere la rete vascolare progettata, richiede una stampante 3D con due estrusori, ma la stampante 3D disponibile in LaBS (Laboratory of Biological Structures) ha un solo estrusore e quindi, è stata stampata una rete vascolare con un unico piano della rete progettata inizialmente. La rete vascolare è stampata in alcool polivinilico (PVA), che è un materiale idrosolubile, poi viene inserita in uno stampo per scaffold fatto di gomma siliconica (Silplay 184/28) e inglobata in una soluzione di idrogelo (composta da: 50% di gelatina e 50% di alginato) e una volta che quest'ultima passa dallo stato di sol a quello di gel, la rimozione della rete vascolare viene fatta attraverso la perfusione attiva con acqua distillata. Lo stampo per scaffold in silicone è stato prodotto da un master ottenuto con la combinazione di due pezzi stampati in acrilonitrile butadiene stirene (ABS) attraverso la stampante 3D FDM. Sono stati anche progettati un coperchio e una base per sigillare lo stampo per scaffold in silicone per prevenire la contaminazione batterica per il suo possibile utilizzo con idrogeli carichi di cellule, queste parti sono state stampate in acido polilattico (PLA) e processate a posteriori per formare dei fori passanti e filettati in modo da permettere di sigillarle, assemblando il dispositivo finale attraverso l'avvitamento di quattro viti. Il dispositivo finale è stato connesso ad un circuito idraulico per rimuovere la rete vascolare in PVA attraverso la perfusione attiva con acqua distillata. I tempi richiesti per la completa rimozione del PVA sono troppo lunghi (più di 7 ore), questo può compromettere la vitalità cellulare quando si ha a che fare con idrogeli carichi di cellule, ma è possibile cambiare il tipo di idrogelo o il suo metodo di reticolazione in modo da ridurre questi tempi. Inoltre il diametro dei canali ottenuti nell'idrogelo è nell'ordine di quello di piccole arterie e non di capillari, ma possono essere ridotti utilizzando una stampante 3D con prestazioni migliori e riducendo il tempo richiesto per la completa rimozione della rete vascolare dall'idrogelo. Inoltre i diametri dei canali nello scaffold vascolarizzato ottenuto sono più grandi di quelli della rete vascolare stampata, questo è dovuto al fatto che il PVA assorbe acqua quando è inglobato nell'idrogelo e durante la perfusione attiva. Quindi è necessario considerare questo fenomeno durante la progettazione di successive reti vascolari da utilizzare per vascolarizzare scaffold seguendo questa procedura. Il presente lavoro di tesi rappresenta un passo in avanti nella vascolarizzazione di scaffold perché conferma la possibilità di utilizzare una procedura economica, recentemente sviluppata per vascolarizzare scaffold. Negli studi successivi sarà necessario provare ad ottenere la rete vascolare su più piani nello stesso o in un migliore idrogelo per confermare la versatilità della procedura, la quale può essere applicata a diversi tipi di reti vascolari e, una volta che è stata ottenuta, effettuare la stessa procedura con le cellule per raccogliere dati sulla reale possibilità di ottenere costrutti ingegnerizzati vascolarizzati attraverso questa procedura.