Characterization and optimization of the antibiotics loading and release processes for laser and MAO treated titanium surfaces

Biomaterials must have good mechanical, physical, chemical properties and high biocompatibility because they interact with a biological system [1]. There are numerous materials that can be used for medical devices. The “gold standard” for hard tissue replacement is represented by titanium and titanium alloys. This choice is due to the high corrosion resistance, the great tensile strength, flexibility and resistance to body fluids [7] [10]. The main problem connected with medical devices is the emergence of infections and consequently the failure of the implant. This failure requires an additional revision surgery and leads to high economic costs. The failure is due to the development of biofilms that cannot be destroyed by the use of classical antibiotics [37]. The prophylaxis procedure normally provides a systemic administration of antibiotics that prevents the bacterial adhesion. The implant-associated infections play an important role in surgery. About 5-10% of all surgeries dealing with a placement of internal fixation device or knee prosthesis lead to the formation of an infection [2]. The main problem connected with the systemic administration of antibiotics is the risk of toxic effects or the development of resistant bacteria, if the antibiotic concentration is below the minimal inhibitor concentration (MIC). For this reason, in the last years the research is focussing on implants that can deliver the antibiotic directly from the surface of the implant [3]. To generate an antibacterial surface on the implant are used many different chemical and physical treatments as plasma spray deposition, laser etching, grit-blasting, anodic spark deposition, micro-arc oxidation etc. [37]. Among the advanced methods for the surface modification the micro-arc-oxidation (MAO) is actually very popular for odontology implants. Besides this treatment in the last years the surface treatment by laser etching has attracted the attention for its easily controllable and reproducible results but it is not yet used in clinical procedures [30] [38]. The modification of titanium induces a nanostructure on the surface that in the same time can store the antibacterial solutions and promote the growing of the tissue to guarantee the implant stability on the bone [30]. Several works are made for the controlled loading and release of an antibacterial solution on the surrounding tissue, but at the moment the loading phase present many problems about the reproducibility of the process. In particular the delivery of antibacterial compound has to stay above the minimum value to guarantee the protection and besides the value of toxicity. To prevent the formation of biofilms the release of the antibiotic must be maintained for a given time.   Within this project the antibiotics rifampicin and penicillin G have been selected as bioactive molecules which are filled into the pores. These two types of antibiotics have completely different solubility in water. The penicillin G has a high solubility of 300 mg/ml in water and in this respect it can be compared with gentamicin. Rifampicin has a low solubility of about 10 mg/ml in water and can be compared with vancomycin . The release of the two antibiotics must be characterized in respect to the velocity [6] and the amount in µg per cm2 implant surface. The first working point is the optimization of the loading process. The aim was a concentration of minimum 100 µg/cm2 of penicillin G for both the laser and the MAO structured samples. Due to the lower MIC of the rifampicin a much smaller amount of 10 µg/cm2 must be stored within the pores of the surface [4]. The first problem is the optimization of the loading process to could make a prediction about the amount of delivery from the surface of titanium. In details the surface after all the treatment are made by pores and spots or structure conformation that can store antibiotic. The pores are associated to capillaries, for this reason the filling of them is associated with the surface energy of the biomaterial and the surface tension of the antibacterial solution. Instead the filling of pores is directly proportional with the increasing of surface energy and the decreasing of the surface tension [5] [125]. Some approaches to increase the surface energy of the coating by plasma activation were successfully made. But the effect of the plasma activation is not long-stable. Otherwise, different types of solutions have also been studied [3] [125]. In particular to decrease the surface tension of the solution were examined different types of alcohol that did not introduce problems as solubility and stability. In particular it was found that a mixture of water with 50% 2-propanol or 50 % ethanol leads to a strong decrease of the surface tension. In addition to the pores in the surface there are surface conformation that cannot be treated in the same way as the pores because they have a smoothed geometry. For this reason were tested three different loading procedures. Dip coating gave the best performance in respect of the loading effectiveness and the process reproducibility. The most important parameter for the dip coating process is the speed of extraction from the solution [122]. Suffering this technology is possible to make a directly correlation of loading effectiveness and the process parameters. After the optimization of the antibiotic storage by matching the surface energies and using the dip coating process to fill the pores the velocity of the release was characterized. A clear dependence of the viscosity of the release medium and the release velocity was found. The release in the saline is faster than in agar, because within the agar medium no convection takes place. The release in the polyethylene glycol water-mixture is faster compared to the agar and lower compared to saline. Additionally, a second parameter defines the velocity of the release. The pore diameter can be controlled by a further deposition of a plasma polymer film on the surface of the samples. The pore diameter becomes smaller and the velocity can be delayed. But the storage capacity decreases also. Finally the last aim of the project consists on the validation of the process with the evaluation of the linearity and the reproducibility of the process [7]. In detail for each kind of antibiotic the dependence of the amount of release from the concentration of the loading solution was characterized and a clear linear behaviour between both quantities was found.

I biomateriali devono avere buone proprietà meccaniche, fisiche, chimiche e un'elevata biocompatibilità in quanto interagiscono con il sistema biologico [1]. Ci sono numerosi materiali che possono essere utilizzati per la produzione di dispositivi medici. Il "gold standard" per la sostituzione dei tessuti duri è rappresentato dal titanio e dalle sue leghe. Questa scelta è dovuta all'elevata resistenza alla corrosione, alla trazione, alla flessibilità e ai fluidi corporei [7] [10]. Il problema principale connesso ai dispositivi medici è lo sviluppo di infezioni e di conseguenza il fallimento dell'impianto. In questo caso è richiesto un ulteriore intervento chirurgico di revisione, il quale comporta costi economici elevati nonché problemi psicologici al paziente. Il fallimento è dovuto allo sviluppo di biofilm che non può essere distrutto con il solo utilizzo di antibiotici classici [37]. La procedura di profilassi fornisce normalmente una somministrazione sistemica di antibiotici che previene l'adesione batterica. Le infezioni associate all'impianto sono un importante fattore da tenere in considerazione in chirurgia. Circa il 5-10% di tutti gli interventi chirurgici che si occupano del posizionamento di un dispositivo di fissazione interna o di una protesi portano alla formazione di un'infezione [2]. Il principale problema legato alla somministrazione sistemica di antibiotici è il rischio di effetti tossici o lo sviluppo di resistenza batterica all’antibiotico se la concentrazione di antibiotici è inferiore alla concentrazione inibitoria minima (MIC). Per questo motivo, negli ultimi anni la ricerca si è concentrata su impianti in grado di rilasciare l'antibiotico direttamente dalla superficie dell'impianto [3]. Per generare una superficie antibatterica sull'impianto vengono utilizzati molti trattamenti chimici e fisici diversi, come la deposizione al plasma, l'incisione al laser, la sabbiatura, l’ossidazione anodica, la micro-arc-oxidation ecc. [37]. Tra i metodi avanzati per la modifica della superficie, la micro-arc-oxidation (MAO) è in realtà molto diffusa per gli impianti in campo odontoiatrico. Oltre a questa procedura negli ultimi anni il trattamento superficiale mediante incisione laser ha attirato l'attenzione per i suoi risultati facilmente controllabili e riproducibili, ma non è ancora utilizzato nelle procedure cliniche [30] [38]. La modifica del titanio induce sulla superficie una nano struttura che nello stesso tempo può immagazzinare le soluzioni antibatteriche e promuovere la crescita del tessuto per garantire la stabilità dell'impianto sull'osso [30]. Sono stati sviluppati diversi progetti per il caricamento e il rilascio controllato della soluzione antibatterica sul tessuto circostante, ma al momento, la fase di caricamento presenta molti problemi sulla riproducibilità del processo. In particolare il rilascio di un composto antibatterico deve rimanere al di sopra del valore minimo per garantire la protezione e sotto al valore di tossicità. Inoltre il rilascio di antibiotico deve essere eseguito per un tempo stabilito per prevenire l'adesione del biofilm. I due antibiotici candidati come molecole bioattive, che possono quindi essere caricati sulla nano-struttura del materiale, sono la rifampicina e la penicillina G. Questi due tipi di antibiotici hanno una solubilità completamente diversa in acqua: la penicillina G ha un'alta solubilità di 300 mg/ml in acqua e in questo senso può essere paragonata alla gentamicina, mentre la rifampicina ha una bassa solubilità di circa 10 mg/ml in acqua e può essere confrontata con la vancomicina. Il rilascio dei due antibiotici deve essere caratterizzato rispetto alla velocità [6] e alla quantità in μg per cm2 di superficie dell’impianto. Il primo punto su cui porre l’attenzione è l'ottimizzazione del processo di caricamento. L'obiettivo è una concentrazione di almeno 100 μg/cm2 di penicillina G sia per il laser sia per i campioni strutturati MAO. A causa della MIC più bassa della rifampicina, deve essere immagazzinata nei pori della superficie una quantità minore di circa 10 μg/cm2 [4]. Il primo problema è l'ottimizzazione del processo di caricamento per poter effettuare una previsione sulla quantità di rilascio dalla superficie del titanio. In dettaglio, la superficie dopo il trattamento è composta da pori che possono immagazzinare antibiotici. I pori sono associati ai capillari per questo motivo il loro riempimento è direttamente proporzionale all'aumento di energia superficiale e alla diminuzione della tensione superficiale [5] [125]. In questo lavoro sono prese in esame alcune soluzioni tecniche per aumentare l'energia superficiale, come ad esempio, il processo di attivazione mediante il trattamento al plasma. Ma l’effetto dell’attivazione del plasma diminuisce nel tempo. Nel caso opposto vengono anche studiati differenti tipi di soluzione che possono diminuire la tensione superficiale della stessa [3] [125]. In particolare, vengono esaminate diverse miscele con vari tipi di alcool che permettono una diminuzione della tensione superficiale, senza però introdurre problemi di solubilità e stabilità. Pertanto, la tensione superficiale delle soluzioni acquose di carico mostra una diminuzione con la progressiva aggiunta di 2-propanolo o etanolo. Nel dettaglio, è stato trovato che una miscela di acqua con il 50% di 2-propanolo o il 50% di etanolo porta ad una forte diminuzione della tensione superficiale. Oltre ai pori nella superficie sono presenti ulteriori avvallamenti che non è possibile trattare allo stesso modo perché hanno una geometria più smussata. Per questo motivo sono state testate tre diverse procedure di caricamento. Il dip coating ha fornito le migliori prestazioni in termini di efficienza di carico e riproducibilità del processo. Il parametro più importante per il dip coating è la velocità di estrazione del provino dalla soluzione [122]. Applicando questa tecnologia è possibile realizzare una correlazione diretta tra efficacia di carico e parametri di processo. Dopo l'ottimizzazione del processo di carico dell’antibiotico, sfruttando la tensione superficiale e il dip coating, è stata quindi caratterizzata la velocità di rilascio. È stata trovata una chiara dipendenza della viscosità del mezzo di rilascio e della velocità di rilascio. Il rilascio nella soluzione salina è più veloce che in agar, poiché all'interno del mezzo agar non avviene alcun moto convettivo. Il rilascio nella miscela di glicole polietilenico è più veloce rispetto all'agar e inferiore rispetto alla soluzione salina.Inoltre, il diametro dei pori definisce la dipendenza della velocità di rilascio. Questo può essere controllato da un'ulteriore deposizione al plasma di un film sulla superficie dei campioni. Il diametro dei pori diventa più piccolo e la velocità può essere ritardata. Ma anche la capacità di immagazzinare antibiotico diminuisce. Infine, l'ultimo obiettivo del progetto consiste nella convalida dello stesso mediante la valutazione della linearità e della riproducibilità del processo [7]. Nel dettaglio, per ogni tipo di antibiotico viene realizzata una gamma di soluzioni, caricate su entrambe le nano strutture in titanio e infine valutato il rilascio. La correlazione è fatta da un modello di regressione lineare che può consentire la valutazione della relazione dei dati.