Development of a disposable enzymatic biosensor for diabetes monitoring

Introduction Diabetes has been one of the most common diseases affecting the world’s population reaching, just in 2016, 415 million of worldwide cases distributed as seen in Figure 1, with a total of 5,83%. Figure 1:Diabetes atlas in 2016, as can be seen the prevalence of diabetes is concentrated in First and Second World countries with some exception being Sudan and Papua New Guinea. Third World countries present some degree of diabetes due to poor dietary intake which is directly in opposition to the First World which is instead characterized by bad dietary behaviour. (Source: International Diabetes Federation, Diabetes Atlas) Diabetes is divided into two classes: • Type I diabetes (as known as insulin-dependent diabetes) characterized by an immune response which destroys the endocrine pancreas which produces insulin, glucagon and other regulatory hormones • Type II diabetes (as known as insulin-independent diabetes) characterized by a decreased permeability of cellular membranes toward insulin, which is produced at physiological levels by the pancreas, resulting in overall higher blood glucose concentration Type II diabetes represents the largest portion of the cases (which is around the 90%) and is a consequence of both hereditary predisposition [1] and a bad lifestyle (lack of exercise, high fat and sugar dietary intake) [2]. State of the Art Diabetes screening has been based on 2 classes of biomarkers which are blood glucose concentration and glycated substrates, which are the product of long-time exposure of proteins to glucose causing glycation, such as Glycated Albumin (GA) and glycated haemoglobin (HbA1c). Both biosensing and laboratory techniques has been applied for blood glucose monitoring, while glycated substrates are, by now, only measured through to High-Performance Liquid Chromatography, Electrophoresis and ELISA-assays. Glucose biosensing is a proven method for managing day-to-day diabetes, however it affects the life quality of the patient which need to perform multiple tests during the day and is highly sensitive to glycemia fluctuations as seen in Figure 2. Figure 2: Daily blood glucose concentration variation during 24 hours of a diabetic patient, the arrows signal the big meals of the day which are breakfast, lunch and dinner. As seen, particularly in diabetic patients, glucose level are inconsistent with respect to the meals and do not share similar amplitudes, needing a non-uniformed insulin subministration (Source: [3]) Glycated substrates are characterized by both medium and long-time stability due to the life cycle of the substrates, but are not trivial to monitoring, needing in fact to be performed with expensive machinery and by trained staff. The following work aimed at uniting the interesting characteristics of the glycated substrate biomarkers with the low-cost and simplicity of enzymatic biosensing techniques. Materials and Methods The sensor used in the work consisted into two similar designs, both obtained through sputtering on a PET sheet, which differences are based on the materials used to fabricate the electrodes obtaining the configuration in Figure 3. Figure 3: Newer sensor design, while the thickness of the electrodes is the same the material of the electrodes and the surface area of the working electrode are different, being far wider in the old design. The old design shows less conductive capacity but higher durability while the lower electrode area of the new design guarantees higher conductivity whilst it needs lower enzyme coverage of its surface. The enzyme used has been Amadoriase I, modified with a cysteine in position 356 for enhanced thermal stability, drop-casted onto the electrode area (indicated in Figure 4) following two different protocols denominated respectively WET and DRY. Figure 4: Batch of old designs prepared via the DRY protocol, the arrow indicated the drop-casting area on which the enzyme is entrapped and where the target solution will be positioned for testing Electronical tests were performed with an AMEL Potentiostat/Galvanostat in order to characterize the sensor and construct a calibration curve for it. The first test has been a chronoamperometry which measure the current flowing into the electrolytic cell after a constant potential is applied at the working electrode for a certain amount of time. Expecting a rapid exhaustion of the target substrate, a current cut-off has been introduced at 2 seconds due to the current achieving the greater variation in slope in that point as seen in Figure 5. Figure 5:Chronoamperometry of a sensor, the red line signals the 2 seconds mark, while the grey lines represents the slopes before the red mark, while the black line is the slope of the 2 seconds mark The results of different chronoamperometries at different concentrations of substrates are plotted on a concentration/current graph in order to obtain the standard curve of the sensor. Real-Time Monitoring is needed in order to observe the behaviour of the substrate while it passes through the enzyme to reach the electrode, which is important to characterize the kinetic of the reaction in the sensor environment. The test set-up is prepared as the previous amperometries but the time is not fixed and target substrate is introduced at increasing concentration in the electrolytic cell at fixed time intervals in order to observe the peak magnitude and delays as seen below in Figure 6. Figure 6:Expected RTM wave form, for each substrate insertion corresponds a delayed current spike while the long-time current does not reach the value of the pure buffer solution (before the first insertion), due to the presence of by-products of the redox reaction (Source: [4]) A cyclic voltammetry has been performed in the end to verify if the activity of the enzyme was different from the sensor alone. The cyclic voltammetry measures the current of when the voltage is increased toward a maximum value through a fixed step and then the voltage is brought back at the initial value. This cyclic behaviour of the potential is important to observe both the oxidation of the target species on the first half-cycle and the relative reduction happening in the second half-cycle. Some limitations, characteristic of glycated proteins’ biosensing, are still present but can be overcome by working on the enzyme itself. 1. Two fundamental steps have been followed in the work to produce a new mutant: Modification of the enzyme amino acids’ sequence through Rosetta Commons loop-modelling 2. Molecular Dynamic’s (MD) simulations through which stability of several mutants is tested in order to obtain the best candidate to produce. Rosetta Commons loop-modelling started from a cut of the second α-helix of the enzyme sequence and generated mutants by filling the void with 2,3 and 4 amino acids and performing on them an energetic ranking. Of all the 150 designs generated, 15 has gone through MD simulations (5 for each loop length) after which a best candidate was selected and, through the online tool PROSS, generated 7 more stable mutants which follow the same process of the loop-designs as seen in the flow chart at Figure 7 below. Figure 7:Flow chart showing the number of candidates which brought to the final selection, the orange arrows shows which criteria modified the number of candidates at each passage toward the selection of the best candidate Results The sensor results, in particular for the new design, showed a good consistency coupled with easily measurable current value, though these results came to be only for the DRY protocol due to a better immobilization of the enzyme which generated a good calibration curve (Figure 8), while the WET protocol results were discarded. Real-Time Monitoring shown no interference from the enzyme layer against the substrate route to the electrode, while the voltammetry shown a distinct activity of the enzyme with respect to the sensor alone. Figure 8: Calibration/standard curve resulting from the best immobilization and testing protocol performed on the new sensor design The enzyme’s MD simulations have shown that 3 amino acids loop filling generates the most stable proteins, PROSS generated mutants showed a similar stability between one another (stability estimated through RMSD, RMSF and RMS with respect to the wildtype protein). The best loop designed protein have been the Loop3_35 model and its mutant A was the most stable of all as seen in the RMSD-plot in Figure 9 and in the RMSF-plot in Figure 10. Figure 9:RMSD plot of the wildtype, the best loop design mutant and the final mutant obtained through PROSS showing greater stability by a large margin from the wildtype too Figure 10:RMSF plot of the wildtype, the best loop design mutant and the final mutant obtained through PROSS showing greater stability of the modification area in which the cut was performed Future works will be aimed to enlarge the catalytic site of the enzyme in order to accommodate whole glycated proteins and could be tested on the sensor with whole blood sample.

Introduzione Il diabete è stata una delle malattie più comuni che colpiscono la popolazione mondiale raggiungendo, solo nel 2016, 415 milioni di casi distribuiti in tutto il mondo come mostrato nella Figura 11, con un totale del 5,83%. Figura 11:Atlante del diabete nel mondo, si può vedere come la prevalenza del diabete si concentra nei paesi del Primo e Secondo Mondo, con le eccezioni del Sudan e di Papua Nuova Guinea. Le nazioni del Terzo Mondo presentano un certo grado di diabete a causa di una dieta povera di nutrienti, in opposizione del Primo Mondo in cui la causa del diabete è uno sbilancio di nutrienti (Fonte: International Diabetes Federation, Diabetes Atlas) Il diabete è diviso in due classi: • Diabete di tipo I (noto come diabete insulino-dipendente) caratterizzato da una risposta immunitaria che distrugge il pancreas endocrino che produce insulina, glucagone e altri ormoni regolatori • Diabete di tipo II (noto come diabete insulino-indipendente) caratterizzato da una ridotta permeabilità delle membrane cellulari verso l'insulina, che viene prodotta a livelli fisiologici dal pancreas, con conseguente aumento della concentrazione complessiva di glucosio nel sangue Il diabete di tipo II rappresenta la maggior parte dei casi (che è circa il 90%) ed è una conseguenza sia della predisposizione ereditaria [1] che di uno stile di vita scorretto (mancanza di esercizio, assunzione di grassi e zuccheri) [2]. Stato dell’Arte Lo screening del diabete è stato basato su 2 classi di biomarker che sono concentrazione di glucosio nel sangue e substrati glicati, che sono il risultato dell'esposizione prolungata di proteine al glucosio causando glicazione, come albumina glicata (GA) ed emoglobina glicata (HbA1c). Sia biosensing che tecniche di laboratorio sono state applicate per il monitoraggio della glicemia, mentre i substrati glicati sono, finora, misurati solo attraverso cromatografia liquida ad alte prestazioni, elettroforesi e saggi ELISA. Il biosensing del glucosio è un metodo collaudato per gestire il diabete giorno per giorno, tuttavia influisce sulla qualità della vita del paziente il quale necessita di eseguire più test durante il giorno ed è altamente sensibile alle fluttuazioni glicemiche come mostrato nella Figura 12. Figura 12:Glicemia durante l'arco della giornata in un paziente diabetico con indicati i pasti maggiori (colazione, pranzo e cena). È importante notare come sia l’ampiezza che l’inconsistenza del verificarsi dei picchi renda la somministrazione di insulina al paziente non uniforme (Fonte: [3]) I substrati glicati sono caratterizzati da stabilità sia a medio che a lungo termine a causa del ciclo di vita dei substrati, ma non sono banali da monitorare, che devono essere effettivamente eseguiti con macchinari costosi e personale addestrato. Il seguente lavoro mirava a unire le interessanti caratteristiche dei biomarker del substrato glicato con la tecnologia a basso costo e la semplicità delle tecniche di biosensing enzimatico. Materiali e Metodi Il sensore utilizzato nel lavoro consiste in due disegni simili, entrambi ottenuti mediante sputtering su un foglio di PET, la qui differenza principale si basa sui materiali utilizzati per fabbricare gli elettrodi ottenendo la configurazione in Figura 13. Figura 13:Il design del sensore più recente, mentre lo spessore degli elettrodi è lo stesso, il materiale degli elettrodi e la superficie dell'elettrodo di lavoro sono diversi, essendo molto più ampi nel vecchio design e di diverso materiale. Il vecchio design mostra una minore capacità conduttiva ma una maggiore durabilità mentre l'area dell'elettrodo inferiore del nuovo design garantisce una conduttività più elevata che richiede quindi una minore copertura della sua superficie da parte dell’enzima. L'enzima utilizzato è stato Amadoriasi I, modificato con una cisteina in posizione 356 per una maggiore stabilità termica, depositato a goccia sull'area dell'elettrodo (indicata in Figura 14) seguendo due diversi protocolli denominati rispettivamente WET e DRY. Figura 14:Lotto di vecchi progetti preparati tramite il protocollo DRY, la freccia indicava l'area di colata su cui è intrappolato l'enzima e dove verrà posizionata la soluzione target per il test I test elettronici sono stati eseguiti con un Potentiostato/Galvanostato AMEL per caratterizzare il sensore e costruire una curva di calibrazione per ciascun design. Il primo test è stato una cronoamperometria che misura la corrente che scorre nella cella elettrolitica dopo che un potenziale costante viene applicato all'elettrodo di lavoro per un certo periodo di tempo. Prospettando un rapido esaurimento del substrato bersaglio, è stato introdotto un cut-off di corrente a 2 secondi a causa del fatto che la corrente ha raggiunto maggiore variazione di pendenza in quel punto come mostrato nella Figura 15. Figura 15:Cronoamperometria di un sensore, la linea rossa segnala il cut-off dei 2 secondi, le linee grigie rappresentano le pendenze prima del segno rosso, mentre la linea nera è la pendenza del segno dei 2 secondi. I risultati di diverse amperometrie a diverse concentrazioni di substrato bersaglio sono tracciati su un grafico concentrazione/corrente al fine di ottenere la curva di calibrazione del sensore. Il monitoraggio in tempo reale è necessario per osservare il comportamento del substrato mentre passa attraverso l'enzima per raggiungere l'elettrodo, il quale è un fattore importante per caratterizzare la cinetica di reazione nell'ambiente del sensore. Il set-up di prova viene preparato come la precedente amperometria ma il tempo non è fissato e substrato a concentrazione crescente vengono introdotte nella cella elettrolitica ad intervalli di tempo fissi per osservare l'ampiezza e i ritardi di picco come mostrato nella Figura 16. Figura 16: La forma d'onda RTM prevista, per ogni inserimento di substrato corrisponde a un picco di corrente ritardato mentre la corrente di lungo periodo non raggiunge il valore della soluzione tampone pura (prima del primo inserimento), a causa della presenza di sottoprodotti della reazione di ossidoriduzione (Fonte: [4]). La voltammetria ciclica misura la corrente di quando la tensione viene aumentata verso un valore massimo attraverso un passo fisso e quindi la tensione viene riportata al valore iniziale. Questo comportamento ciclico del potenziale è importante per osservare sia l'ossidazione delle specie bersaglio nel primo semiperiodo sia la riduzione relativa che si verifica nel secondo semiperiodo. Una voltammetria ciclica è stata eseguita alla fine per verificare se l'attività dell'enzima fosse diversa dal solo sensore e se l’ossidazione avviene al corretto potenziale. Alcune limitazioni, caratteristiche del biosensing delle proteine glicate, sono ancora presenti ma possono essere superate lavorando sull'enzima stesso. Due passi fondamentali sono stati seguiti nel lavoro per produrre un nuovo mutante: 1. Modifica della sequenza degli amminoacidi degli enzimi attraverso modellazione con il software Rosetta Commons. 2. Simulazioni di Dinamica Molecolare (MD) attraverso le quali viene testata la stabilità di diversi mutanti al fine di ottenere un possibile candidato da produrre e testare. La modellizzazione con Rosetta Commons è iniziata da un taglio della seconda α-elica della sequenza amminoacidica e ha generato 150 mutanti connettendo l’area del taglio con 2,3 e 4 amminoacidi ed eseguendo su di essi una classificazione energetica. Di tutti i 150 progetti generati, 15 hanno superato le simulazioni MD (5 per ogni tipo di connessione), dopo di che è stato selezionato un candidato migliore e, tramite lo strumento online PROSS, sono stati generati 7 mutanti più stabili che, seguendo lo stesso processo dei 15 mutanti precedenti, producono il candidato finale (Figura 17). Figura 17:Diagramma di flusso che mostra il numero di candidati che hanno portato alla selezione finale, le frecce arancioni mostrano quali criteri hanno modificato il numero di candidati ad ogni passaggio verso la selezione del miglior candidato. Risultati I risultati del sensore, in particolare per il nuovo design, hanno mostrato una buona consistenza dei risultati accoppiata ad un valore di corrente facilmente misurabile. Questi risultati sono stati ottenuti solo per il protocollo DRY a causa di una migliore immobilizzazione dell'enzima che ha generato una buona curva di calibrazione (Figura 18), mentre i risultati del protocollo WET sono stati scartati. Figura 18:Curva di calibrazione risultante dal miglior protocollo di immobilizzazione e test eseguito sul nuovo design del sensore Il monitoraggio in tempo reale non mostrava alcuna interferenza da parte dello strato enzimatico contro il percorso del substrato verso l'elettrodo, mentre la voltammetria mostrava una distinta attività dell'enzima rispetto al sensore da solo. Le simulazioni di dinamica molecolare dell’enzima hanno mostrato che il riempimento del taglio con 3 amminoacidi genera le proteine più stabili, i mutanti generati dal PROSS hanno mostrato una stabilità simile tra loro (stabilità stimata attraverso RMSD, RMSF e RMS rispetto alla proteina wildtype). La migliore proteina progettata in loop è stata il modello Loop3_35 e il suo mutante A era il più stabile di tutti, come mostrato nel grafico RMSD nella Figura 19 e nel grafico RMSF nella Figura 20. Figura 19:Grafico RMSD della proteina wildtype, il mutante migliore del loop-design e il mutante finale ottenuto tramite PROSS che mostra una maggiore stabilità con un ampio margine anche dal wildtype. Figura 20:Grafico RMSF della proteina wildtype, il mutante migliore del loop design e il mutante finale ottenuto tramite PROSS che mostra una maggiore stabilità dell'area di modifica in cui è stato eseguito il taglio I lavori futuri mireranno ad allargare il sito catalitico dell'enzima per accogliere proteine glicate intere e potrebbero essere testati sul sensore con campioni di sangue intero.