The halogen zipper project. A study on the effect of the halogen bond and other non-covalent interactions on the aggregation state of the GCN4-p1 coiled-coil peptide

Coiled-Coils are a well-known class of proteins that is characterised by a highly predictable and reproducible α-helical structure; among them, a 30-amino acid leucine zipper transcription factor known as GCN4-p1 has been extensively studied; this peptide is known to spontaneously form a dimer under physiological conditions. Of particular interest to this project is the study by Gonzalez et al., which demonstrated that by replacing the key Asparagine residue in position 16 of the amino acid sequence with an Alanine, a hydrophobic pocket was created; upon addition of an aromatic ring such as benzene, which was found to bind within this pocket, the aggregation state of the peptide shifted from a dimer to a trimer. With the aim of investigating the effect of specific noncovalent interactions - namely the Halogen bond and the Hydrogen bond - on the aggregation state of GCN4-p1, our group decided to replace the Asparagine residue with different aromatic amino acids. Tyrosine was chosen for its ability to form a Hydrogen bond; a para-iodo-Phenylalanine and a 2,3,5,6-tetrafluoro-4-iodo-Phenylalanine were selected to explore the formation of a Halogen bond under different conditions; eventually, a methylated-Phenylalanine was included to create a control sequence where only non-specific, hydrophobic interactions could form. These GCN4-X16 variants were mixed with the Alanine-containing sequence described by Gonzalez and subsequently analysed via X-Ray Diffraction, DSC and CD. These analyses, together with QM simulations of the environment within the hydrophobic pocket, were used to confirm the hypothesis that the formation of a HB or an XB specifically yield a heterotrimer assembly for the peptide under scrutiny. To the best of our knowledge, this is the first time that a Halogen bond was engineered to produce a protein-protein interaction able to uniquely yield a specific aggregation state.

I “Coiled-Coils” sono una classe di proteine caratterizzata da strutture α-elicoidali altamente prevedibili e riproducibili. Il fattore di trascrizione GCN4-p1 è una catena di 30 amminoacidi appartenente a questa categoria che è stata oggetto di innumerevoli studi. Questo peptide forma spontaneamente una struttura dimerica, tuttavia in uno studio di Gonzalez et al., a seguito della sostituzione di una Asparagina in posizione 16 della sequenza amminoacidica con una Alanina, questo stato di aggregazione è stato convertito in un trimero grazie all’ interazione con un anello benzenico all’ interno della tasca idrofobica creata dalla sostituzione stessa. Partendo da questa scoperta, il nostro gruppo ha sostituito questa Asparagina con diversi amminoacidi aromatici allo scopo di valutare l’effetto di interazioni non-covalenti, nello specifico il legame ad alogeno e il legame a idrogeno, sullo stato di aggregazione di GCN4-p1. Per prima cosa si è scelta la Tirosina per la sua abilità di formare un legame a idrogeno; successivamente si è deciso di considerare una para-iodio-Fenilalanina e ad una 2,3,5,6-tetrafluoro-4-iodio-Fenilalanina per valutare la formazione di legami ad alogeno; infine, si è scelto di utilizzare una Fenilalanina metilata come sequenza di controllo, capace unicamente di formare interazioni idrofobiche non specifiche. Le sequenze contenenti questi residui sono state mischiate a quella, precedentemente descritta da Gonzalez, contenente una Alanina e successivamente analizzate tramite diffrazione ai raggi X, calorimetria differenziale (DSC) e spettroscopia a dicroismo circolare. Queste analisi, unite a una serie di simulazioni quanto-meccaniche della tasca idrofobica, all’ interno della quale avvengono le interazioni di nostro interesse, sono state sfruttate per dimostrare l’ipotesi secondo la quale la formazione di un legame ad idrogeno e quella di un legame ad alogeno producono specificatamente degli aggregati trimerici. Ad oggi, questa è la prima volta che un legame ad alogeno è stato ingegnerizzato per costruire un’interazione tra diverse catene proteiche.