Surface functionalization for biomedical applications

In this study a novel method for the functionalization of solid substrates with amine-rich cationic polymers like PAMAM dendrimers, is presented. One of the biggest challenges in this field is the deposition of a stable coating that can retain its transfection ability and antibacterial properties when dry, and after storing for a reasonable amount of time. With this aim a bicomponent system composed by a functionalized substrate and a dendrimer PAMAM coating is set up. The substrate is a silica glass thiolated surface and the polymeric coating is composed by a second generation PAMAM dendrimer, conjugated to the surface using a heterocrosslinker, MAL-PEG-NHS. Two surface silanization methods were tested: one with TEOS and one with CH3. The first one creates a -OH group rich layer and the second one a -C3H7 group rich layer. The presence of one kind of those functional groups is necessary for the subsequent functionalization with MSH for having a highly thiolated surface. Different concentration of MSH were tested in order to understand how it can affect the thiol surface density. The thiol functionalization methods tested in this thesis work are the sol-gel dip coating technique and the spin coating technique. Their influence on the thiol deposition was analysed through Ellman’s test, which is a useful tool to determine the thiol density in a solution by means of spectrophotometric analysis thanks to the DTNB reaction with sulfhydryl groups. The shelf life of thiolated surfaces was evaluated by Ellman’s tests performed 2 days and 30 days after the deposition process. The MAL-PEG-NHS linker production resulted difficult and presented low yielding, in contrast with the literature describing this process. Afterwards, fluorescein isothiocyanate labelled dendrimers were conjugated with the MAL-PEG-NHS linker and the efficiency of the binding reaction with superficial thiols was studied by means of spectrophotometric analysis at 495 nm excitation. The thiol density resulted highly affected by the MSH concentration in sols, while the different deposition method barely affected the final sulfhydryl group density. In fact, spin coated surfaces resulted slightly denser in thiols with respect to the dip coated surfaces. Adhesion tests showed that for polymer concentrations higher than 500 µM, the concentration of FITC labelled molecules bound to the surface reaches a plateau, due to the capping of the free thiol group on the functionalized surface, while for polymer concentrations lower than 125 µM the concentration of deposited species is negligible. In fact, the maximum concentration of deposited PAMAM of 333 µM is reached after 10 minutes of incubation of the polymer solution on 60% 0.5M TEOS dip coated surfaces. The evaluation of pDNA condensation ability showed a strongly reduced complexation ability in MAL conjugated PAMAM. PAMAM-PEG-MAL presented a homologous behaviour in respect to non-conjugated PAMAM, but the concentration of amines needed to reach the maximum complexation of NAs was 3 nmol, while for standard second generation PAMAM was 0.3 nmol of amines. This can be due to the absence of primary amines in the external part of the polymer molecule, that in order to complex the NAs must rely only on the internal basic amines, thus hampering the condensation ability of the dendrimer. In conclusion, the surface functionalization through alkoxysilanes resulted successfully and reproducible. The linker synthesis has to be optimized in order to achieve greater efficiency and less time-consuming reactions. More studies are needed on the PAMAM-MAL conjugation process, since the complete functionalization of all primary amines too strongly affects the complexation ability of the transfectant, thus preventing the complete condensation of nucleic acids. Finally, the PAMAM-PEG-MAL deposition process was carried out with no experimental complications, since it is based on the click reaction of maleimide with sulfhydryl groups that gives no by-products and occurs in very small incubation times.

Questo lavoro di tesi sperimentale si prefigge lo scopo di sviluppare un metodo di deposizione di coating che possano unire le proprietà antibatteriche e di gene delivery dei polimeri cationici come i dendrimeri di PAMAM con le proprietà meccaniche di superfici solide e allo stesso tempo proteggere gli acidi nucleici internalizzati dal polimero prima della deposizione sulle superfici. Il fine ultimo di coating superficiali di questo tipo può portale all’importante sviluppo di superfici che mantengano un’elevata capacità di trasfezione anche dopo vari giorni dalla loro funzionalizzazione. L’ottimizzazione di questo processo si divide in tre step fondamentali: la produzione di superfici tiolate, la sintesi di un linker a base di polietilenglicole e successiva coniugazione del dendrimero, e la deposizione del coating sulle superfici. La prima fase della ricerca è stata perciò incentrata sulla produzione, attraverso il metodo del sol gel di superfici ad alto tenore di tioli. Sono stati prodotti dei sol a base di un elemento idrolizzabile, come il trietossisilano (TEOS) o n-propiltrimetossisilano (CH3), ed un portatore di tioli, il 3-mercaptopropl trimetossisilano (MSH). Due diversi tipi di sol sono stati sviluppati, uno a base di TEOS ed uno a base di CH3. Il primo in ambiente acido tende ad idrolizzarsi depositando sulla superfice dei radicali -OH, il secondo invece, idrolizzandosi anch’esso in ambienti acidi, rilascia sulla superfice dei gruppi funzionali -C3H7. Partendo da questi due sol sono state sviluppate 4 soluzioni diverse per entrambi. Esse presentano una concentrazione di MSH variabile tra 0% e 60%. Questi sol sono stati depositati su delle superfici in vetro di silice attraverso due diversi metodi di deposizione: il metodo del dip coating e la tecnica dello spin coating. Il primo si basa sull’immersione ed estrazione di un campione in una soluzione a velocità costante, il secondo invece sfrutta la forza centrifuga per ricoprire omogeneamente tutta la superfice del provino della soluzione depositata su di esso. Entrambi i metodi hanno successivamente bisogno di un processo di essiccamento in una stufa a 100°C per il completo fissaggio del rivestimento. Gli studi sull’influenza dei vari parametri testati (quali la concentrazione di MSH, tipo di elemento idrolizzabile o metodo di funzionalizzazione) sulla qualità di deposizione dei coating sono stati effettuati attraverso il test di Ellman, che permette di calcolare la densità di tioli della superfice analizzata. Esso sfrutta una reazione chimica dell’acido 2,2'-dinitro-5,5'-ditiodibenzoico DTNB con i gruppi reattivi -SH. La reazione del DTNB è veloce ed ha un’efficienza del 100%, formando un composto giallo, il 2-nitro-5-tiobenzoato (NTB), che può essere rilevato attraverso analisi spettrofotometriche. Dalle analisi effettuate il parametro che influenza maggiormente la qualità di funzionalizzazione della superficie risulta essere la percentuale di MSH presente nei sol depositati, è stato infatti osservato un incremento dei tioli superficiali direttamente proporzionale alla sua concentrazione. Le differenze tra i sol a base di TEOS e quelli a base di CH3 è pressoché trascurabile, mentre si è visto che la tecnica dello spin coating fornisce deposizioni leggermente più dense in legami solfidrilici. Questo risultato potrebbe essere dovuto alla flessione del vetrino verso la base del supporto che durante il processo di spin coating impedisce al sol depositato di distribuirsi omogeneamente lungo tutta la superfice del campione. La sintesi del rivestimento polimerico che andrà a ricoprire le superfici tiolate si basa sulla produzione di una seconda generazione di PAMAM coniugato con un linker a base di polietilenglicole alle cui estremità sono presenti i gruppi n-idrossisuccinimide e maleimide, chiamato NHS-PEG-MAL. Questi due gruppi reattivi sono estremamente selettivi rispettivamente per le ammine primarie presenti sulla parte esterna del PAMAM e per i tioli presenti sulle superfici da funzionalizzare. La sintesi di questo linker a partire dal trietilen glicole è stata ottimizzata ed ogni passaggio è stato verificato attraverso Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare. Un altro dendrimero di PAMAM che presenta un marker fluorescente, è stato invece sintetizzato per essere utilizzato nella verifica dell’avvenuto legame tra il rivestimento e le superfici tiolate. Della fluoresceina isotiocianato (FITC) è stata legata in rapporto 1:1 tra le moli di PAMAM e quelle di FITC attraverso il legame tioureico. La corretta sostituzione delle ammine primarie sul PAMAM è stata verificata attraverso spettroscopia nucleare ed il composto risultante è stato coniugato con il linker di NHS-PEG-MAL. La deposizione della soluzione polimerica sulle superfici tiolate è stata effettuata in fase acquosa su un’area prefissata utilizzando delle maschere in silicone. Per testare l’efficienza di deposizione il dendrimero legato al marcatore fluorescente è stato depositato a differenti concentrazioni su campioni di superfice tiolata. Attraverso un macchinario di acquisizione di immagini dotato di lampada UV, il Kodak Image Station, sono stati acquisiti i dati di fluorescenza delle gocce di soluzione polimerica depositate. Dopo due tempi di incubazione differenti (5 e 10 minuti) la superficie è stata lavata in acqua ed etanolo. Una volta ottenuta la completa asciugatura delle superfici, le zone funzionalizzate precedentemente con il rivestimento sono state reidratate con con lo stesso volume d’acqua utilizzato per la deposizione. Sono state acquisite perciò nuove immagini e la fluorescenza residua è stata confrontata con quella iniziale. I risultati ottenuti presentano valori molto simili per deposizioni a concentrazioni di polimero più alte di 0,5 mM, raggiungendo un plateau, invece per concentrazioni più basse di 0,12 mM il livello di fluorescenza non è stato apprezzabile. Questo dimostra che per alte concentrazioni di polimero si ha un esaurimento dei tioli disponibili per la creazione di legami dovuto all’ingombro sterico delle particelle di PAMAM coniugato e dalla densità iniziale di tioli. Il valore di concentrazione massimo ottenuto è stato 3,5 µM/mm2. Sono state in seguito testate le capacità di condensazione del DNA da parte del PAMAM coniugato, mostrando un comportamento simile a quello del suo corrispettivo non coniugato, ma con un’efficienza di condensazione fortemente indebolita dall’assenza delle ammine primarie all’esterno della molecola. Futuri studi sono necessari al fine di garantire al PAMAM coniugato con maleimide una capacità di complessazione pari o superiore a quella del suo corrispettivo non coniugato. Un’ulteriore ottimizzazione della coniugazione di questo polimero che possa consentire la funzionalizzazione di una singola ammina primaria con il gruppo funzionale maleimide potrebbe portare ad una condensazione degli acidi nucleici competitiva con gli standard attuali.