Analisi proteomica applicata a sistemi nano di drug-delivery : studio delle interazioni tra nanotubi di carbonio funzionalizzati e proteine plasmatiche

“Nanomedicine” is a branch of nanotechnology applied to medical and sanitary context. The aims of nanomedicine are diagnosis, treatment and prevention of disease or traumas that may compromise human health through application of molecular knowledge and systems to human body. The main feature of nanotechnologies is the high surface/volume ratio, responsible of unique optical, magnetic, morphological and mechanical properties. Concretely, the application of these technologies to biological fields regards all those processes and mechanism that occur at cellular level after the insertion of nanostructures, which might specifically with biomolecules, cells or tissues. Carbon Nanotubes (CNTs), are nanoparticles characterized by graphene sheets rolled-up to form a hollow tubular structure. There are two different classes of Carbon Nanotubes, according to number of graphene layers: Single Walled Carbon Nanotubes (SWCNTs), formed by only one layer, and Multi Walled Carbon Nanotubes (MWCNTs), characterized by more than one graphene layers. After their discovery by Sumio Iijima, in 1991, production and purification methods have been improved in order to minimize the presence of morphological or structural defects. Thanks to their versatility and the excellent physical properties, interest and research on Carbon nanotubes have grown exponentially in many different fields. In particular, recently, CNTs are being studied for design drug delivery systems because the high aspect ratio, combined with abundance of π-bonds, makes them easily functionalizable with different chemical groups, therapeutic molecules, drugs, nucleic acids or enzymes. Exogenous materials as CNTs are able to interact with most of the biomolecules present in the biological environment, developing a specific biocorona, mainly formed by proteins. The analysis of structure and composition of protein corona is essential to understand the side effects generated on host organism and the type of interactions that nanotubes may develop when they are present in physiological environment. An important role is played by specific chemical group that could be linked to the surface of CNTs, able to influence their behavior. The goal of functionalization is the increase of solubility or dispersibility in biocompatible media, reducing toxic and cytotoxic effects. The final aim of the following thesis is the evaluation of protein corona developed on differently functionalized MWCNT, after their incubation in human plasma. The proteins present on different nanotubes are compared using proteomic techniques, such as SDS-PAGE for protein separation and Mass Spectrometry analysis for protein identification. The choice of functionalization group was performed after a careful bibliographic research, focusing on the most interesting groups used in therapeutic context: - Group ESA, used in drug delivery system as a spacer for drugs or bigger fuctionalizing groups; - Group F1, an ammino group recently used to conjugate anticancer drugs (HCPT); - Group PEG, highly biocompatible for the possibility to be recognized as self by biological system; - Group OLEIC, compared to PEG in terms of biocompatibility because its long carbonic chain is similar to PEG for steric bulk on the nanotube surface; Material and Methods The MWCNT carbon nanotubes were synthesized within our research group through the typical Chemical Vapor Deposition protocol and functionalized with Glutaryl Peroxide, for next chemical reactions. Starting from this species, we have obtained the four functionalizations analyzed: ESA, F1, PEG e OLEIC. For each type of functionalized carbon nanotubes, aliquots of 60 μl were added to 1940 μl of human plasma with protein concentration of 70 mg/ml. Then, plasma and MWCNT solutions were incubated for 4 hours under stirring at 37°C and filtrated on suitable filters. Proteins present on MWCNTs surface, forming biocorona, were eluted with 20 mM DTT in 4% SDS solution at boiling point. The obtained solution was subjected to one-dimensional SDS-PAGE, in order to separate proteins, according to their molecular mass, by application of an electric field, able to induce the migration of different proteins inside a discontinuous 12% polyacrylamide gel. Step of protein identification was performed using a mass spectrometer made by electronspray ion source and an ion trap analyzer (LC/ESI-MS), where peptide mixtures were injected after protein digestion by Trypsin. All mass/charge spectra, generated by ionized peptide mixtures, were analyzed using MASCOT software (v. 2.3.0, 2010), able to compare all experimental data with peptide spectra present in downloaded database. After identification, proteins were classified according their molecular function and their cellular compartment through Gene Ontology. Results and discussion Carbon nanotubes were chemically analyzed through thermogravimetric curve to valuate purity and degree of functionalization. The purity of the starting MWCNTs was >95%, a value similar to those of the CNTs reported in the cited literature. The results were compared considering similar functionalized chemical groups on MWCNT’s surface: F1 vs. ESA and OLEIC vs. PEG. The data obtained considering ESA- and F1- MWCNTs could be summarized as following: - The analysis of SDS-PAGE gels has revealed a major intensity of proteins bands present in the lane of functionalized MWCNTs than in unfunctionalized ones. Also mass spectrometry analysis has confirmed the high affinity of f-MWCNTs for human plasma proteins, increasing the number of identifications in eluates of biocoronas formed in these carbon nanotubes. - The Gene Ontology analysis, performed to correlate each protein with its specific functional activity, has revealed specific interactions between f-MWCNTs and human plasma proteins. In fact MWCNT-ESA’s biocorona was specifically formed by proteins with Hemoglobin Binding activity; while MWCNT-F1’s biocorona was characterized by proteins with Arylesterase activity, secreted within the circulatory system and responsible for association of HDLP,. These findings may suggest a possible improvement of biocompatibility for functionalized carbon nanotubes. The comparison between the functionalized PEG nanotubes and OLEIC- MWCNTs has led to the following considerations: - The intensity of proteins bands in the lane of OLEIC- MWCNTs was major than in lane of PEG-MWCNTs, probably due to a different composition of biocorona. Such hypothesis seemed to be confirmed by the high number of identified proteins in OLEIC- MWCNTs eluates,. The lower number of identifications for PEG-MWCNT could be due to a reduced affinity for plasma environment, caused by the plyethylne glycol functionalization. Nevertheless, the reduction of biocorona could favor biocompatibility preventing the increase of dimension and the activation of immune response. - The Gene Ontology analysis has showed a specific interaction of PEG-MWCNTs with proteins, characterized by Receptors Binding or Heterodimeritazion Activity. The OLEIC group was formed by a protein corona, similar to those present on ESA- and F1-MWCNTs. All studies concerning drug delivery systems based on nanotubes or nanoparticles, have pointed the importance to form a protein corona able to be recognized as “self” by the immune system, preventing the attack of lymphocytes and macrophages. On the other hand, researches have considered also the dimension of biocorona: a too thick and bulky protein corona could modify the size of the drug/enzyme delivery system, activating the immune response in the host. The balance between the type and the number of proteins seemed to occur with conjugation of PEG to carbon nanotubes, which is, not by chance, the most functionalizing group used in drug delivery system. The reported data have to be considered as a starting point for future experimental research, aimed to evaluate in vitro and in vivo the dynamic of formation of the MWCNT-PEG’s protein corona inside the bloodstream. Moreover, a complete understanding of the cytotoxic effects of the nanostructure must be achieved before any possible application.

La nanomedicina è una branca della nanotecnologia applicata al contesto medico-sanitario. Si occupa, attraverso l’uso di nanosistemi e conoscenze molecolari del corpo umano, di diagnosi, di trattamento e di prevenzione di patologie o traumi che possono compromettere la salute dell’uomo. La peculiarità delle nanotecnologie deriva dalla scala delle dimensione dei sistemi usati: l’elevato rapporto superficie/volume conferisce alle nanostrutture particolari proprietà ottiche, elettriche, magnetiche, morfologiche e meccaniche. In particolare, l’applicazione di queste tecnologie all’ambito biologico riguarda tutti quei processi e meccanismi che si verificano a livello cellulare ed in cui l’inserimento di nanostrutture può generare interazioni specifiche con biomolecole, cellule o tessuti. I nanotubi di carbonio (CNTs), una delle nanostrutture più utilizzate, sono costituiti da “fogli” di grafene avvolti su se stessi formando una struttura tubulare cava. Si differenziano a seconda del numero di strati (pareti), che li costituiscono, in Single Walled Carbon Nano Tubes (SWCNTs) o Multi Walled Carbon Nano Tubes (MWCNTs). Negli anni successivi alla loro scoperta (1991), i metodi di produzione e purificazione si sono sempre più affinati in modo da ridurre al minimo la presenza di difetti morfologici o strutturali. L’interesse nei CNTs è cresciuto in modo esponenziale grazie alle proprietà ottiche, termiche, meccaniche, elettriche uniche che li rendono molto versatili. In particolare negli ultimi anni, i CNTs sono oggetto di studio per la progettazione di sistemi di drug delivery in quanto l’elevato rapporto superficie/volume, unito alla struttura elettronica ricca di legami π, li rende facilmente coniugabili con diversi gruppi chimici, molecole terapeutiche, farmaci, acidi nucleici o enzimi. All’interno dell’ambiente biologico, nanomateriali esogeni, come i nanotubi, generano interazioni con gran parte delle biomolecole presenti a livello fisiologico, sviluppando una biocorona costituita prevalentemente da agglomerati proteici. L’analisi della struttura e della composizione della biocorona proteica è di fondamentale importanza per comprendere il tipo di interazione che il nanotubo sviluppa con l’ambiente biologico e gli eventuali effetti che questa può generare sull’organismo. Un ruolo importante è svolto da gruppi chimici specifici che possono essere legati alla superficie dei nanotubi per influenzare il loro comportamento. L’obiettivo generale della funzionalizzazione dei CNTs è l’aumento della solubilità o disperdibilità in mezzi biocompatibili (o acquosi), riducendone gli effetti tossici e citotossici. Lo scopo finale del seguente lavoro di tesi è la valutazione qualitativa del protein corona sviluppato a seguito dell’incubazione di nanotubi, diversamente funzionalizzati all’interno di plasma umano. Utilizzando tecniche di proteomica, come l’elettroforesi monodimensionale, e la spettrometria di massa, per l’identificazione proteica, si sono confrontate le proteine presenti sulle superfici di differenti nanotubi. La scelta dei gruppi chimici funzionalizzanti la superficie dei nanotubi è stata fatta dopo un’accurata ricerca bibliografica, focalizzando l’attenzione su quelli più interessanti dal punto di vista terapeutico: - Il gruppo ESA, utilizzato nei sistemi di drug delivery come spacer per farmaci o gruppi funzionalizzanti maggiori; - Il funzionalizzante F1, gruppo amminico utilizzato di recente nella realizzazione di un sistema sperimentale per la coniugazione di un antitumorale (HCPT); - Il PEG, per la sua elevata biocompatibilità data dalla capacità di essere riconosciuto come self dai sistemi biologici, riducendo in modo sensibile la citotossicità; - Il gruppo OLEIC, caratterizzato da una struttura altamente biocompatibile, è stato posto a confronto con il PEG in quanto catene carboniose simili in termini di ingombro sterico sulla superficie del nanotubo. Materiali e metodi I MWCNTs , utilizzati per la parte sperimentale, sono stati sintetizzati all’interno del nostro gruppo di ricerca attraverso il tipico protocollo di Chemical Vapor Deposition (fonte) e funzionalizzati con Glutaril Perossido. A partire da questa specie, si sono realizzate le quattro funzionalizzazioni oggetto di analisi: ESA, F1, PEG ed OLEIC. Per ogni tipo di funzionalizzazione, aliquote di 60 μl di f-MWCNTs sono stati sospesi in 1940 ml utilizzando plasma umano a concentrazione proteica di circa 70 mg/ml. Quindi le soluzioni di plasma e MWCNTs sono state incubate per 4 ore in agitazione a 37°C e sottoposte a filtrazione. Le proteine del biocorona, formatosi sulla superficie dei MWCNTs, sono state eluite con una soluzione composta da 20 mM DTT e 4% SDS, a temperatura di ebollizione. L’eluato ottenuto è stato sottoposto ad elettroforesi monodimensionale mediante SDS-PAGE, in modo da separare le proteine presenti in base alla loro massa molecolare attraverso un campo elettrico capace di indurre la migrazione delle diverse proteine all’interno di un gel discontinuo di poliacrilamide al 12%. L’identificazione proteica è avvenuta mediante l’utilizzo di uno spettrometro di massa, dotato di sorgente ionizzante a elettronspray e di analizzatore a trappola ionica (LC/ESI-MS). I campioni sono stati iniettati in massa previa riduzione/alchilazione delle proteine e digestione triptica delle stessa. Gli spettri massa/carica, generati dalle miscele peptidiche, sono stati analizzati attraverso software MASCOT (v. 2.3.0, 2010), che mediante l’applicazione di uno specifico algoritmo è in grado di confrontare i dati sperimentali con spettri presenti in banche date, identificando le proteine presente nel campione analizzato. Le sequenze proteiche identificate sono state infine classificate in base alla funzione molecolare e alla locazione cellulare attraverso Gene Ontology. Risultati e discussione A seguito delle procedure di funzionalizzazione, i nanotubi sono stati analizzati mediante analisi termogravimetriche per la valutazione della purezza e del grado di funzionalizzazione. La purezza è risultata essere >95%, simile a quella dei CNTs utilizzati nei nei lavori riportati nella letteratura citata. Dalle curve TGA si è inoltre dedotto il grado di funzionalizzazione di tutti e quattro i nanotubi oggetto di studio. I risultati ottenuti dalle differenti funzionalizzazioni sono stati elaborati e valutati attraverso un confronto a coppie tra i nanotubi F1 ed ESA e tra i nanotubi PEG e OLEIC in modo da far emergere possibili differenze e analogie che caratterizzano le specifiche protein corone. I risultati del confronto tra i gel monodimensionali dei nanotubi di partenza, dei nanotubi ESA e di quelli funzionalizzati F1 possono essere riassunti nei seguenti due punti - A parità di volume di campione, si è notato un aumento di intensità nelle bande dei gel relativi ai campioni ottenuti usando i nanotubi funzionalizzati rispetto a quelli dei nanotubi di partenza, utilizzati come controllo. Oltre ad un elevato numero di proteine affini a tutte tre le funzionalizzazioni, la presenza di proteine specifiche per l’una o per l’altra funzionalizzazione mette in luce la possibilità che l’interazione sviluppata con il plasma dipenda dalle caratteristiche del gruppo coniugato al nanotubo. - L’analisi GO, svolta per associare ad ogni proteina la specifica attività funzionale, fa emergere l’interazione con particolari proteine specifiche del fluido ematico, come le Hemoglobin Binding per quanto riguarda la corona dei nanotubi ESA, o proteine con attività enzimatica Arylesterase secrete all’interno del sistema circolatorio e responsabili dell’associazione di lipoproteine ad elevata densità per quanto riguarda i MWCNT-F1. Questo può essere indice di un miglioramento in termini di emocompatibilità rispetto ai nanotubi di controllo. Il confronto tra i nanotubi funzionalizzati PEG e i MWCNT-OLEIC ha portato a sviluppare le seguenti considerazioni. - L’intensità delle bande del gel, relativo ai nanotubi funzionalizzati con acido oleico, risulta maggiore rispetto a quella delle bande dei nanotubi peghilati. L’ipotesi di una differente composizione tra le due biocorone sembra essere confermata dal numero di proteine specifiche identificate: molto più elevato per i MWCNT-OLEIC rispetto ai MWCNT-PEG. Per quest’ultimi si è ipotizzata una minor interazione con le proteine presenti nell’ambiente plasmatico. - L’analisi GO mostra la specificità del PEG per l’interazione con proteine aventi la funzione di Receptor Binding e di Heterodimeritzation Activity, entrambe presenti nel fluido ematico a differente concentrazione. Il gruppo oleico, considerato nel confronto col PEG per il simile ingombro sterico, mostra invece un protein corona più simile a quello dei nanotubi funzionalizzati ESA o F1. In tutti gli studi riguardanti drug delivery basati su nanotubi o sistemi nano particellari, nonostante sia appurata l’importanza la limitazione della tossicità tramite la formazione di una biocorona che consenta il riconoscimento della struttura esogena come “self” da parte del sistema immunitario, si sottolinea come protein corone troppo spesse e ingombranti possano modificare la dimensione e la percezione del sistema di trasporto farmaco/enzima, attivando così la risposta immunitaria. Tale equilibrio, tra tipo di proteine adese e numero di interazioni, sembra realizzarsi con l’aggiunta alla superficie del nanotubo del PEG, che non a caso risulta il gruppo funzionalizzante più utilizzato nei sistemi di drug delivery. I dati raccolti aprono lo scenario a future ricerche sperimentali mirate a valutare in vivo e in vitro il comportamento dei nanotubi peghilati, al fine di comprende le dinamiche di formazione e le peculiarità della biocorona dal momento dell’inserimento nel circolo ematico fino al raggiungimento del sito target. Inoltre, l'eventuale applicabilità deve essere preceduta dalla totale comprensione degli effetti citotossici della nano struttura.