Characterization of a time-domain near-infrared spectroscopy device and its application on skeletal muscle

The following Master Thesis work regards the characterization and application of a time domain (TD) near-infrared spectroscopy (NIRS) to non-invasively characterize optical be- haviour, oxidative metabolism and hemodynamics of skeletal muscle in healthy subjects. Work has been done in collaboration with Istituto di Bioimmagini e Fisiologia Moleco- lare (IBFM) and Istituto di Fotonica e Nanotecnologie (IFN) of Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR). NIRS is a powerful spectroscopic technique used in several fields (e.g. food and agri- culture, life sciences, medical and pharmaceutical) to non-invasively and non-destructively test samples allowing their analytical and chemical characterization. In the biomedical field it makes use of light to investigate optical properties of tissues allowing to non- invasively monitor their hemodynamics and oxidative metabolism. Since in the 600-1000 nm spectral range light absorption by the main tissue chromophores (i.e.water, lipid, and hemoglobin) is relatively low, light can penetrate through some centimetres of tis- sue. Moreover, the difference in the absorption spectra of oxygenated (O2Hb) and de- oxygenated hemoglobin (HHb) allows the measurement of their concentration as well as the derivation of physiologically relevant parameters like total hemoglobin concentration (tHb) and blood oxygen saturation (SO2) which are extracted in the context of oximetry. Three possible NIRS techniques are available: continuous wave (CW), frequency do- main (FD) and time domain (TD) NIRS. Continuous wave measures the attenuation of light with constant intensity within the tissue. It represents the most compact and affordable alternative despite the high degree of simplification related to chromophore concentration extraction as well as the impossibility to obtain absolute values but only variations. Frequency Domain approach measures attenuation and phase shift of light with precise frequency, allowing to obtain absolute values of chromophores concentra- tion. The most complex and expensive but meaningful alternative is time domain NIRS, which delivers pulses of light with known duration (hundreds of picoseconds) to gather the biological tissue impulse response, thus allowing to measure optical (absorption a and reduced scattering coefficient ′ s of the tissue) and oximetry-related parameters. Compared to other techniques able to monitor muscle oxidative metabolism, NIRS could lead several advantages. For example, it can directly measure local oxidative metabolism despite breath-by-breath gas analysis. Moreover, it has the advantage of non-invasiveness and painless/comfort and cost effectiveness. Presently, CW-NIRS represent the most widespread technique, principally because of its relatively low cost and portability. However, it doesn’t allow to decouple scattering from absorption contribution in the tissue and has strong assumptions. Besides, It doesn’t allow to obtain tissue oxygen saturation SO2. Nowadays, only one commercial TD-NIRS device is present. Only few laboratory pro- totypes have been developed by research groups located in academic or public research centres, including Politecnico di Milano. Anyway, few TD-NIRS studies on muscle have been performed and almost no optical optical characterization was made. In general, sev- eral aspects about NIRS signal are still unclear. Besides, NIRS on muscle still presents limitations and open questions like effect of adipose tissue, myoglobin contribution in NIRS signal and behaviour of scattering coefficient during exercise. A time domain NIRS medical device has been used in this thesis work. It is important to mention that the device can be utilized for both laboratory analyses and clinical studies. In order to obtain reliable data from the device, performance assessment should be carried out. This can be accomplished by means of several tests contained in three dif- ferent protocols: the Basic Instrument Performance (BIP), MEDPHOT and nEUROPt. Basic Instrument Performance (BIP) protocol concerns the recording of basic character- istics of time-domain instrumentation which influence quality and accuracy of measure- ments in clinical applications. It is composed by four tests: characterization of source components of the device (namely, all the components involved in light delivery to the tis- sue), responsivity of the detection system (i.e. efficiency of detecting low light intensities emerging from the tissue), differential nonlinearity of timing electronics (i.e. uniformity of time binning in photon counting systems), instrument response function (IRF) charac- terization (i.e. impulse response of the system itself), where different IRF characteristics are evaluated (e.g. shape, stability over time). MEDPHOT assesses the capability of the device to estimate absorption and scattering co- efficients. In this protocol, phantoms with known optical properties (called conventional value) are measured and estimated optical parameters are compared with conventional ones. It is divided into five tests: linearity of computed a and s against conventional value, accuracy of optical parameters estimation respect to conventional value, noise, where the lowest acceptable measured signal (in terms of photon counts of the recorded impulse response of the phantom) capable to produce reliable estimation of optical pa- rameters is determined, stability of a and ′ s measurement over time, reproducibility, where a and ′ s are measured in three different days in the same experimental condi- tions. nEUROPt addresses the main features with direct relevance on device performance in clinical applications. Two features were assessed on a mechanically switchable solid phantom able to simulate absorption changes: sensitivity towards detection of small lo- calized absorption changes and spatial resolution, by investigating depth discrimination and lateral localization of absorption changes. Results indicated that the device is capable to reliably perform measurements. In particular, the system had shown a minimum warm up time of 60 minutes. Linearity and accuracy in the estimation of optical parameters in the domain of biological tissues has been found. Noise test had shown that more than 400 103 photons in a single impulse response of the phantom are required to obtain a reliable estimation of both optical pa- rameters. Stable estimation a and s quantification over time (uncertainty<1%) when the system is already warmed up was obtained. nEUROPt evidenced the capability of the system to sensibly detect localized absorption changes both in depth and lateral lo- calization. The already described TD-NIRS device was used for an in vivo NIRS-based func- tional study (fNIRS) of skeletal muscle in eleven healthy subjects. They were asked to perform three tests: at first, an arm-cranking exercise on a mechanical flywheel ergome- ter at sub-maximal constant workload was executed, after a recovery time an incremental workload arm-cranking exercise until voluntary exhaustion was performed and, after an- other recovery, an arterial cuff occlusion was practised. Each test was composed by an initial baseline period were the subject was asked to stay relaxed, a task period were the exercise (or cuff occlusion) was performed and a final a recovery. Right and left biceps brachii were measured by means of two NIRS devices, the first one exploiting a CW approach and the second one a TD approach.. Other parameters of biological relevance were measured during the protocol, however only TD-NIRS measurements were analysed in this work. Three main studies were performed: Differential Pathlength Factor (DPF), optical parameters and oximetry paramters analysis. The DPF is a CW-related parameter used to extract chromophore concentrations. Since CW technique commonly employs a single and constant parameter but it is in theory dependent on wavelength and interfibre distance of the system, the DPF of each subject at two different wavelengths and two interfibre distances (i.e. the distance be- tween the light injection fibre and detection one) was computed by means of TD-NIRS time resolved reflectance curve. Furthermore, statistical analyses about inter-subject variability and investigation about significant variation with respect to wavelength and interfibre distance. Results showed significant DPF variation between different subjects and wavelengths, thus possibly evidencing lack of accuracy in quantitative CW measure- ments as they are commonly performed. Characterization of optical parameters was performed for both a and ′ s. Inter- subject variability, wavelength-dependent variation, investigation about significant vari- ations in different time periods of the same exercise and comparison between different tests considering the same time period (e.g. comparison of baseline values between con- stant workload, incremental and occlusion) was carried out. Results about a evidenced significant inter-subject variability. Wavelength-dependent variability was present except for baseline period in constant workload test (namely the first exercise), possibly indicating such equality as a possible indicator of rest condition. Tests comparison in the same time period evidenced a higher baseline value in constant workload test, indicating a non-complete return to initial rest condition. Maximum a value was found in task period of occlusion and, since it is utilized to obtain maximum oxygen extraction capacity, it is likely to assume that it represent the maximum value obtainable from the measured muscle. Results about ′ s had shown inter-subject and wavelength variability. Comparison be- tween different time periods had shown debatable results. Since a partial coupling be- tween a and ′ s exist due to fitting process, it is risky to conclude that ′ s changes during the exercise. Further investigations with simulations or a more homogeneous sta- tistical sample are needed. If ′ s changes over time will be found, CW-NIRS quantitative measurements will be less accurate because they assume constant scattering over time. Characterization of oximetry parameters was carried out by analysing deoxygenated hemoglobin (HHb), oxygenated hemoglobin (O2Hb) total hemoglobin (tHb) and oxygen saturation (SO2). Assessment of inter-subject variability and comparison between the three different tests in the same time period (e.g. comparison of baseline HHb value be- tween constant workload, incremental and occlusion) were performed. Whole parameters showed inter-subject variability. Tests comparison in the same time period evidenced a higher value in constant workload during baseline period probably because of increased blood supply after the first exercise, with consequent non-return to resting state. Task values comparison in the three different tests evidenced a significant difference for oc- clusion with tHb as only exception. This is because, since the system is closed, no new oxygenated blood is supplied (negligible tHb variation), with consequent reaching of maximum oxygen extraction by the muscle. In conclusion, a reliable TD-NIRS system for measurements on muscle was assessed and in vivo characterization on healthy subject was performed. Subject inter-variability was found for any analysed parameter. A further study should involve more subjects, preferentially operating some categorization like trained against untrained subjects or subdivision on the basis of prevalent metabolism in a mea- sured muscle that is dependent on its composition and practised sport. This could underline non-significant variations as well as lower population variance. DPF analysis evidenced that CW-NIRS quantitative data might not be very accurate, at least as it is commonly implemented. Optical characterization have evidenced marked a variation during the experiment, with possible similarity of baseline a in red and infrared region as rest marker. ′ s had shown variability during the exercise, but further analyses using simulations are required as confirmation because the statistical difference could be due to partial coupling with a due to fitting process. If confirmation takes place, CW-NIRS measurements would extract non accurate oximetry parameters. Oximetry parameters analyses evidenced a non-return to baseline state as well as the maximum oxygen extraction during the occlusion. Such value was not reached even at voluntary exhaustion. Despite the inter-subject variability, a possible range of values for optical and oxime- try parameters characterizing healthy people was found. The next step could be a com- parison with patients with impaired oxidative metabolism. Moreover, repeatability of measurements on muscle on the same population should be investigated to understand if the found range could vary by changing healthy population or exhibit some temporal variation.

Il presente lavoro di tesi concerne la caratterizzazione e l’applicazione di un dispositivo di spettroscopia nel vicino infrarosso (NIRS) risolta nel tempo (TD) con lo scopo di caratter- izzare il comportamento ottico, il metabolismo ossidativo e l’emodinamica del muscolo scheletrico in soggetti sani. Il lavoro è stato svolto in collaborazione con l’Istituto di Bioimmagini e Fisiologia Molecolare (IBFM) e l’Istituto di Fotonica e Nanotecnologie (IFN) del Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR). La NIRS è una tecnica spettroscopica utilizzata in diversi campi (alimentare, scienze della vita, medicina e farmaceutico) in grado di analizzare in maniera non invasiva e non distruttiva diversi campioni in modo da caratterizzarli analiticamente e chimicamente. Nel settore biomedico utilizza la luce per studiare le proprietà ottiche dei tessuti biologici permettendo di monitorare la loro emodinamica ed il metabolismo ossidativo. Siccome nel range spettrale tra i 600 ed i 1000 nm la luce viene assorbita poco dai principali cromofori presenti nei tessuti biologici (acqua. lipidi ed emoglobina), essa può penetrare di qualche centimetro. La differenza nello spettro di assorbimento di emoglobina ossigenata (O2Hb) e deossigenata (HHb) permette di misurare la loro concentrazione all’interno del tessuto oltre alla derivazione di parametri di rilevanza fisiologica come la concentrazione totale di emoglobina (tHb) e la saturazione di ossigeno tissutale (SO2), estratte nel contesto dell’ossimetria. Esistono tre possibili tecniche NIRS: la NIRS ad onda continua (CW), nel dominio delle frequenze (FD) e nel dominio del tempo (TD). La CW misura l’attenuazione luminosa da parte del tessuto di una sorgente ad intensità continua nel tempo. Utilizza una strumentazione più compatta ed economica rispetto alle altre tecniche, tuttavia com- porta delle approssimazioni importanti per estrarre la concentrazione dei cromofori, oltre a non poterne estrarre il valore assoluto ma solo le variazioni. La NIRS FD misura la modulazione in ampiezza e lo sfasamento di un segnale luminoso ad una certa frequenza, permettendo di misurare i valori assoluti di concentrazione dei cromofori. La tecnica più complessa ma anche ricca di informazioni è la TD NIRS. Essa invia impulsi lumi- nosi di una certa durata (centinaia di picosecondi) permettendo di ricavare la risposta all’impulso del sistema, permettendo di misurare il coefficiente di assorbimento a e di diffusione ridotto ′ s oltre ai parametri di ossimetria. Rispetto alle altre tecniche in grado di monitorare il metabolismo ossidativo del muscolo la NIRS comporta diversi vantaggi. Ad esempio, può misurare direttamente il metabolismo ossidativo a livello locale, a differenza dell’analisi dei gas espirati. Inoltre, è una tecnica non invasiva che non comporta né dolore né fastidio al soggetto misurato, oltre ad essere relativamente economica. Al momento la tecnica più utilizzata è la CW-NIRS, soprattutto grazie al costo relati- vamente basso ed alle dimensioni ridotte che ne permettono la portabilità. Tuttavia, essa non permette di disaccoppiare il contributo di assorbimento e scattering nel tessuto, oltre a comportare assunzioni importanti a livello fisico. Oltretutto, non permette di calcolare la saturazione di ossigeno tissutale. Al momento un solo dispositivo TD-NIRS commerciale è presente sul mercato. Pochi altri prototipi sono stati sviluppati da gruppi di ricerca di università o centri di ricerca pubblici, incluso il Politecnico di Milano. Oltreutto, sono stati fatti pochi studi TD- NIRS sul muscolo ed una caratterizzazione ottica del tessuto è praticamente assente. In generale, diversi aspetti riguardanti il segnale NIRS nel muscolo non sono ancora chiari. Oltre a questo, la NIRS presenta limitazione e questioni irrisolte, ad esempio l’effetto del tessuto adiposo ed il contributo della mioglobina nel segnale NIRS o il comportamento del coefficiente di scattering ′s durante l’esercizio fisico. In questo lavoro di tesi è stato utilizzato un dispositivo medico NIRS risolto nel tempo. Si tratta di un dispositivo utilizzabile sia in laboratorio sia in ambiente clinico. Per ottenere delle prestazioni affidabili dal dispositivo è necessario caratterizzarlo. Viene fatto attraverso diversi test contenuti in tre protocolli: il Basic Instrument Performance Protocol (BIP), MEDPHOT e nEUROPt. Il BIP riguarda la registrazione delle caratteristiche base dei dispositivi TD in grado di influenzare la qualità ed accuratezza delle misure in applicazioni cliniche. Si com- pone di quattro test: caratterizzazione dei componenti della sorgente luminosa (tutti i componenti coinvolti nella generazione e trasporto dell’impulso luminoso fino al tessuto), responsività del sistema di detection (capacità di detettare basse intensità luminose prove- nienti dal tessuto), non-linearità differenziale della timing electronics (testa l’uniformità del binning temporale nei sistemi di conteggio dei fotoni), caratterizzazione della risposta all’impulso del dispositivo (IRF), dove diverse caratteristiche dell’IRF vengono valutate (e.g. forma, stabilità temporale). Il MEDPHOT testa la capacità del dispositivo di stimare il coefficiente di assorbimento a e scattering ′ s. In questo protocollo dei phantom dalla proprietà ottiche note (dette valore convenzionale) vengono misurati ed i parametri ottici stimati vengono confrontati con quelli convenzionali. Si divide in cinque test: linearità di a e ′s misurati rispetto ai valori convenzionali, accuratezza nella stima delle proprieà ottiche rispetto al valore con- venzionale, rumore, dove viene misurato il più basso segnale (i.e. la risposta all’impulso del phantom) in grado di dare stima affidabile delle proprietà ottiche, stabilità dei valori di a e ′s misurati nel tempo e riproducibilità, dove a e ′s vengono misurati in tre giorni diversi nelle stesse condizioni sperimentali. Il nEUROPt testa le caratteristiche principali dello strumento di diretta rilevanza nelle applicazioni cliniche. Sono state investigate due caratteristiche su un phantom mecca- nico solido in grado di simulare cambiamenti di assorbimento nel tessuto: la sensibilità nella detezione di piccoli cambiamenti di assorbimento localizzati e risoluzione spaziale, invesigando la capacità di discriminazione di cambiamenti in profondità o in direzione laterale dell’assorbimento. I risultati hanno mostrato che il dispositivo è in grado di fornire misure affidabili. In particolare, il minimo tempo di stabilizzazione dopo l’accensione è 60 minuti. Linearità ed accuratezza sono garantite nel range di proprietà ottiche tipiche dei tessuti biologici. Il test del rumore ha indicato che sono necessari almeno 400 103 photoni nella risposta all’impulso del phantom per ottenere una stima affidabile dei parametri ottici. Si è ot- tenuta una stima stabile nel tempo di a e ′s (incertezza< 1%) quando il sistema era già acceso e stabile. Il nEUROPt ha evidenziato la capacità del sistema di detettare in maniera sensibile i cambiamenti di assorbimento sia in direzione laterale sia in profondità. Il dispositivo TD-NIRS caratterizzato è stato utilizzato per uno studio NIRS fun- zionale (fNIRS) in vivo sul muscolo scheletrico di undici soggetti sani. I soggetti hanno svolto tre test: il primo si trattava di un esercizio di arm-cranking su un cicloergometro a braccia a carico sub-massimale costante. Dopo un certo tempo di recupero, un secondo esercizio di arm-cranking a carico incrementale fino ad esaurimento volontario è stato es- eguito. Dopo un altro periodo di recupero è stata praticata un’occlusione arteriosa. Ogni test era composto da un iniziale periodo di baseline dove il soggetto si trovava in con- dizioni di riposo, un periodo di task dove l’esercizio (o l’occlusione) veniva eseguito ed un tempo di recovery, dove il soggetto si trova nuovamente in condizioni di riposo. Il bicip- ite brachiale destro e sinistro sono stati misurati contemporaneamente con 2 strumenti NIRS, uno CW e l’altro TD. Sono stati misurati altri paramteri di rilevanza fisiologica durante il protocollo, tuttavia solo i dati TD-NIRS sono stati analizzati in questo lavoro di tesi. Tre studi principali sono stati fatti: analisi del Differential Pathlength Factor (DPF), analisi dei paramteri ottici e di ossimetria. Il DPF è un parametro utilizzato nella CW-NIRS per estrarre la concentrazione dei cromofori. Siccome normalmente la CW-NIRS utilizza un solo paramtero costante nelle misure ma in realtà esso è dipendente dalla lunghezza d’onda e distanza interfibra (i.e. la distanza tra fibra che illumina il tessuto e quella che ne raccoglie la risposta all’impulso del tessuto), è stato calcolato con la TD-NIRS il DPF di diversi soggetti a due diverse lunghezze d’onda e due diverse distanze interfibra dalla curva di risposta all’impulso del tessuto. Successivamente sono state eseguite delle analisi statistiche sulla variabilità intersogettiva e riguardo possibili variazioni rispetto alla lunghezza d’onda e distanza interfibra. I risultati hanno mostrato variazione significativa del DPF tra diversi soggetti ed anche rispetto alla lunghezza d’onda, evidenziando quindi una possibile mancanza di accuratezza nelle misure CW-NIRS come sono normalmente implementate. La caratterizzazione dei parametri ottici è stata fattia sia per a che per ′s. Sono stati investigati variabilità intersoggettiva, differenza tra i valori a due diverse lunghezze d’onda, confronto del valori nello stesso esercizio ma in diversi periodi (e.g. confronto tra valore di baseline, task e recovery nel test a carico costante) e confronto tra i valori di diversi esercizi nello stesso periodo temporale (e.g. confronto tra carico costante, in- crementale ed occlusione durante la baseline). I risultati riguardanti a hanno mostrato variabilità intersoggettiva. Differenza signi- ficativa è stata trovata a diverse lunghezze d’onda tranne durante il periodo di baseline del test a carico costante (il primo in assoluto ad essere eseguito), inviduando questa similarità come possibile indicatore dello stato di assoluto riposo. Confronto tra diversi test nello steso periodo temporale ha evidenziato un più alto valore di baseline nel test a carico costante, individuando un non completo ritorno allo stato di riposo iniziale. Il valore massimo di a è stato trovato durante il periodo di task dell’occlusione e, siccome essa è utilizzata per ottenere la massima estrazione di ossigeno da pa parte del tessuto, è ragionevole assumere che si tratti del massimo valore di a possibile per i muscolo in esame. Risultati riguardo ′s hanno evidenziato variabilità intersoggettiva e differenza tra i val- ori alle due lunghezze d’onda. Confronto tra i diversi periodi temporali nello stesso test ha mostrato risultati discutibili. Siccome esiste un accoppiamento parziale tra a e ′s dovuto al processo di fitting, è rischioso concludere che ′s cambia durante l’esercizio. Ulteriori studi tramite simulazioni o una popolazione statistica più omogenea sono nec- essari. Se effettivamente una variazione di ′s durante l’esercizio fosse trovata, le misure quantitative con CW-NIRS risulterebbero meno accurate perchè assumono un coefficiente di diffusione costante nel tempo. La caratterizzazione dei paramteri di ossimetria è stata eseguita analizzando emoglobina deossigenata (HHb), ossigenata (O2Hb), emoglobina totale (tHb) e saturazione di os- sigeno tissutale (SO2). È stata testata la variabilità intersoggettiva e sono stati con- frontati i valori nei tra diversi test nello stesso periodo temporale (e.g. baseline). Tutti i paramteri hanno mostrato variabilità intersoggettiva. Il confronto tra i test nello stesso periodo temporale ha evidenziato differenza significa- tiva durante baseline del test a carico costante rispetto ad incrementale ed occlusione dovuto all’aumentato apporto di sangue al tessuto con conseguente non ritorno allo stato di assoluto riposo. Il confronto tra i diversi test durante il periodo di task ha evidenziato differenza signi- ficativa dell’occlusione rispetto agli altri test con tHb come unica eccezione. Questo è dovuto al fatto di avere un sistema chiuso durante l’occlusione: non può arrivare sangue ossigenato (quindi non si ha variazione di tHb) con conseguente raggiungimento della massima capacità di estrazione di ossigeno da parte del muscolo. In conclusione, è stato testato un sistema TD-NIRS che ha dimostrato affidabilità, poi sono state fatte misure in vivo per la caratterizzazione del tessuto muscolare scheletrico su soggetti sani. Variabilità intersoggettiva è stata trovata per ogni paramtero. Un ulteriore studio dovrebbe coinvolgere più soggetti, preferenzialmente potendo operare categorizzazioni come ad esempio allenati/non o suddivisione in base al metabolismo prevalente nel mus- colo in esame, che dipende dalla composizione del muscolo e dallo sport praticato. In questo modo potrebbero essere evidenziate categorie senza variazione intersoggettiva o comunuque si potrebbe avere una riduzione della varianza della popolazione. L’analisi dei DPF ha mostrato che la CW-NIRS potrebbe non dare misure quantita- tive accurate, almeno come è normalmente implementata. La caratterizzazione ottica ha evidenziato variazione di a durante l’esercizio con la similarità nell’assorbimento a 688 nm ed 828 nm come possibile marker di stato di assoluto riposo. ′ s ha mostrato variazione durante l’esercizio, ma delle simulazioni sono necessarie come conferma a causa del parziale accoppiamento con a dovuto al processo di fitting. Se ciò dovesse essere confermato, la CW-NIRS potrebbe non estrarre parametri di ossimetria accurati. L’analisi dei parametri di ossimetria ha evidenziato un non ritorno allo stato di assoluto riposo oltre alla massima estrazione di ossigeno da parte del tessuto durante l’occlusione. Questo valore non viene raggiunto durante l’esaurimento volontario. Nonostante la variabilità intersoggettiva, un possibile range di valori ottici e di ossime- tria caratterizzanti una popolazione sana sono satti trovati. Il prossimo passo potrebbe comportare comparazioni con soggetti dal metabolismo ossidativo alterato. Inoltre, ripetibilità delle misure sul muscolo sulla stessa popolazione dovrebbero essere inves- tigate per capire se il range ottenuto può cambiare variando i campioni caratterizzanti la popolazione di sani o mostrare variazioni temporali.