3D-printed titanium implants with titania nanotubes : dual-scale topography and drug delivery for bone applications

Bone implant procedures involve millions of people every year worldwide. The main factors still challenging implant success are poor osseointegration, i.e. the lack of a structural and functional connection between prosthesis and living bone, inflammatory responses and bacterial infections. Titanium and titanium alloys are widely used biomaterials for bone implants due to their superior biocompatibility and corrosion resistance, suitable mechanical properties, and natural ability to osseointegrate. To further enhance the inherent tendency of this class of materials to bond with the host bone tissue, the surface of Ti-based implant is often modified to improve cell responses in terms of adhesion, proliferation and differentiation, all factors contributing to successful osseointegration. In particular, surface topography, both at the micro- and nanoscale, can enhance the implant-living bone interaction. Moreover, by adequately modifying the implant surface, it would be possible to realize drug releasing bone implants able to accommodate some therapeutic agent and release it at the implant site in order to treat infections and inflammations. In fact, local drug delivery has recently emerged as a promising alternative to conventional drug administration in order to achieve a highly site-specific and targeted delivery of therapeutics. Herein, a possible surface modification strategy aimed at the creation of drug releasing bone implants with a dual-scale topography is presented. Firstly, dual-scale topography was obtained by electrochemically anodizing samples of two different titanium alloys, Ti-6Al-4V and Ti-5Al-5Mo-5V-3Cr, manufactured by selective laser melting. In this way, it was possible to combine their intrinsic microtopography with the nanotopography offered by titanium dioxide nanotubes (TNTs) generated by anodization. Characterization of the as-printed and as-anodized samples was performed to evaluate parameters of significance in the context of osseointegration. Concerning wettability, it was observed that surfaces with TNTs exhibited high hydrophilicity. However, samples became hydrophobic when stored in the dark for months, hence a plasma treatment using atmospheric air was used to restore their hydrophilic character. The influence of the anodization process parameters on TNTs morphology was examined, and linear dependence of the nanotube diameter on the anodization voltage was identified. Annealing of the as-anodized samples showed that anatase was produced, while preserving the nanotube integrity. Preliminary studies to assess the bioactive properties of the samples showed the spreading of bone-like cells on these substrates and the deposition of mineral during simulated body fluid testing. Therefore, these studies provided promising results to corroborate the hypothesis that dual-scale topography could potentially improve osseointegration. The use of TNT arrays as local drug delivery systems was explored with Ti-6Al-4V samples anodized at 60 V for 30 min (indicated as TNT-Ti64) and loaded with penicillin-streptomycin, a common antibiotic. Firstly, two different methods to load the antibiotic in the nanotubes, i.e. by immersion and by drop casting, were investigated, revealing that loading by drop casting was more efficient. Drug release tests were carried out in vitro by immersing the drug loaded samples in a phosphate-buffered saline solution incubated at 37 °C. Drug release kinetics and extent in time were evaluated for bare TNT-Ti64 substrates and for samples spin coated with one or two layers of either chitosan, poly(ε-caprolactone) (PCL) or poly(3-hydroxybutyrate) (PHB). In all the samples, drug release followed a non-Fickian diffusion mechanism. Presence of polymer coatings made it possible to extend the drug release time up to 33% and reduce the initial burst release. Such effects were more significant for double coated than for single coated samples. Spin coating process was first optimized using glass substrates to determine the angular velocity to be applied in order to obtain similarly thick films of the different polymers. Spin coated TNT-Ti64 samples were characterized in terms of coating thickness, morphology and topography, roughness and wettability. Coating thickness was estimated to be around 1.5-2.5 μm. Morphology, topography and roughness were analogous for uncoated and spin coated samples, showing that the polymer films tended to reproduce the features of the substrates underneath. In terms of wettability, chitosan-coated samples showed a slightly hydrophilic behaviour, while PCL and PHB films were more hydrophobic. For PCL-coated samples, hydrolytic degradation was also evaluated, which was found to be negligible in the time frame of interest.

Ogni anno milioni di persone nel mondo necessitano di protesi ossee, un numero previsto in costante crescita, principalmente a causa dell’invecchiamento della popolazione. I fattori principali che tuttora mettono a rischio il successo di tali protesi riguardano la scarsa osteointegrazione, ovvero la mancanza di un legame strutturale e funzionale tra protesi e osso, e l’insorgere di risposte infiammatorie o infezioni batteriche. Il titanio e le sue leghe sono biomateriali largamente utilizzati nel settore delle protesi ossee grazie alla loro eccellente biocompatibilità e resistenza alla corrosione, adeguate proprietà meccaniche e capacità intrinseca di osteointegrarsi. Per migliorare ulteriormente la tendenza a legarsi al tessuto osseo, la superficie delle protesi in titanio viene spesso modificata per migliorare la risposta cellulare in termini di adesione, proliferazione e differenziazione, tutti fattori che contribuiscono ad un’osteointegrazione ottimale. In particolare, le caratteristiche topografiche della superficie, sia alla microscala che alla nanoscala, possono migliorare l’interazione tra protesi ed osso. Inoltre, modificandone adeguatamente la superficie, è possibile realizzare protesi in grado di accomodare farmaci per poi rilasciarli laddove la protesi viene inserita, in modo da curare infezioni e infiammazioni. Infatti, il local drug delivery (somministrazione locale di farmaci) è considerato un’alternativa promettente alla somministrazione di farmaci convenzionale volta al rilascio di agenti terapeutici in modo altamente mirato e circoscritto rispetto alla zona da trattare. In questo lavoro di tesi viene presentato un possibile metodo per modificare la superficie delle protesi ossee volto alla creazione di strutture idonee al local drug delivery con caratteristiche topografiche su doppia scala, ovvero con dimensioni sia micrometriche che nanometriche. Innanzitutto, tale topografia su doppia scala è stata ottenuta anodizzando dei campioni di due diverse leghe di titanio, Ti-6Al-4V (Ti64) e Ti-5Al-5Mo-5V-3Cr (Ti5553), fabbricati tramite selective laser melting (SLM) (fusione laser selettiva). Ti64 è attualmente la lega di titanio più utilizzata per la realizzazione di protesi ossee, mentre non si registrano utilizzi di Ti5553 in campo biomedico. Tuttavia, tale materiale mostra proprietà ideali in termini di modulo elastico, inferiore a quello del Ti64 grazie al maggiore quantitativo di fase β presente, e quindi più vicino a quello del tessuto osseo. Questo è da considerarsi un vantaggio per evitare il cosiddetto fenomeno di stress shielding, ovvero il riassorbimento dell’osso quando esso non viene sollecitato meccanicamente perché la maggior parte dei carichi viene scaricata sulla protesi, essendo questa più rigida. La produzione dei campioni tramite SLM ha permesso di combinare le loro caratteristiche intrinseche su scala micrometrica con la nanoscala dei nanotubi di biossido di titanio creati per anodizzazione, ottenendo quindi superfici con una topografia su doppia scala.Alcune proprietà di rilievo per quanto riguarda l’osteointegrazione, ovvero bagnabilità, morfologia superficiale e bioattività, sono state caratterizzate sia pre che post anodizzazione. Considerando per esempio la bagnabilità, è stato osservato che inizialmente i campioni anodizzati sono altamente idrofilici, ma tendono a diventare idrofobici nel tempo. Dal momento che protesi ossee con superfici idrofiliche sono da preferirsi per garantire risposte cellulare ottimali volte all’osteointegrazione, i campioni diventati idrofobici sono stati sottoposti ad un trattamento al plasma, ripristinandone l’idrofilicità grazie alle proprietà fotocatalitiche del biossido di titanio. È stata esaminata l’influenza dei parametri del processo di anodizzazione quali voltaggio e tempo sulla morfologia dei nanotubi di TiO2. Per entrambe le leghe di titanio studiate, si è verificato che il diametro dei nanotubi dipende linearmente dal voltaggio applicato durante l’anodizzazione. Nanotubi ottenuti su Ti5553 hanno mostrato un diametro maggiore e una morfologia meno regolare rispetto a quelli su Ti64. Un trattamento di distensione effettuato post anodizzazione ha permesso di ottenere biossido di titanio nella forma cristallina dell’anatasio, senza danneggiare l’architettura dei nanotubi. Test preliminari in vitro tramite seminazione di cellule di tipo osseo hanno evidenziato la proliferazione di tali cellule sui substrati proposti e l’interazione con le loro caratteristiche strutture superficiali. Test di bioattività in simulated body fluid (fluido biologico simulato) hanno evidenziato la presenza di depositi, inclusi cristalli di fosfato e calcio, elementi caratterizzanti la componente minerale delle ossa, sulla superficie dei campioni. Tali risultati sono da considerarsi promettenti in merito all’ipotesi che l’osteointegrazione possa migliorare grazie alla topografia su doppia scala. L’uso dei nanotubi di biossido di titanio per il local drug delivery è stato investigato usando campioni di Ti64 anodizzati a 60 V per 30 min (indicati come TNT-Ti64), riempiti di penicillina-streptomicina, un comune antibiotico. La scelta di tali campioni è stata influenzata dall’attuale maggior interesse in campo biomedico per la lega Ti64 rispetto alla Ti5553. Inoltre la morfologia e le dimensioni dei nanotubi ottenuti nelle condizioni di anodizzazione selezionate sono state ritenute più idonee al contenimento dell’antibiotico. Per prima cosa, sono stati sperimentati due diversi metodi di caricamento dell’antibiotico nei nanotubi, ovvero per immersione o per drop casting (deposizione), il quale si è rivelato essere più efficace. I test di rilascio dell’antibiotico sono stati eseguiti in vitro immergendo i campioni riempiti di penicillina-streptomicina in un tampone fosfato salino incubato a 37 °C. La cinetica e la durata del rilascio sono state studiate per nanotubi sia rivestiti tramite spin coating (rivestimento per rotazione) con uno o due strati di chitosano, policaprolattone (PCL) o poli-3-idrossibutirato (PHB) che senza alcun rivestimento. In tutti i casi, il rilascio di antibiotico è avvenuto seguendo un meccanismo di diffusione non Fickiano. La presenza dei rivestimenti polimerici ha permesso di estendere la durata del rilascio fino al 33% e di ridurlo nelle fasi iniziali, soprattutto nei campioni con il doppio rivestimento polimerico. Il processo di spin coating è stato inizialmente ottimizzato usando dei substrati in vetro, in modo da determinare la velocità angolare da applicare per ottenere rivestimenti con spessori comparabili dei diversi polimeri. I campioni TNT-Ti64 sono stati caratterizzati in termini di spessore dei rivestimenti, morfologia e topografia, rugosità e bagnabilità. Gli spessori dei rivestimenti sono stati stimati essere intorno a 1.5-2.5 μm. I campioni rivestiti hanno evidenziato aspetti di morfologia, topografia e rugosità analoghi a quelli non rivestiti, indicando quindi la tendenza del rivestimento a seguire le caratteristiche del substrato. Per quanto riguarda la bagnabilità, i campioni rivestiti con chitosano sono risultati essere leggermente idrofilici, mentre i rivestimenti di PCL e PHB hanno mostrato un comportamento più idrofobico. Inoltre, è stata investigata la degradazione per idrolisi dei rivestimenti in PCL, che si è concluso essere trascurabile nell’arco temporale di interesse. In conclusione, questo lavoro di tesi ha mostrato come sia possibile ottenere protesi ossee con una topografia superficiale su doppia scala, ritenuta ottimale per quanto riguarda l’osteointegrazione. Questo approccio è stato applicato non solo per la lega Ti64, già utilizzata e studiata nel settore delle protesi, ma anche per la lega Ti5553, un materiale non ancora impiegato in questo campo ma con caratteristiche promettenti. Inoltre, è stato investigato l’utilizzo dei nanotubi di biossido di titanio, con o senza rivestimenti polimerici, per il local drug delivery. Allo stato dell’arte, non sono presenti molti esempi di combinazione di topografia su doppia scala e local drug delivery, ma si ritiene che la combinazione di questi due aspetti consenta sia di migliorare l’osteointegrazione che di ridurre il rischio di infezioni e infiammazioni.