Idrogeli di RGD-pectina per patch cardiaci : incapsulamento cellulare in strutture fibrose

Introduction Worldwide, myocardial infarction (MI) is the most fatal cardiovascular disease. Cardiac transplantation remains the ultimate treatment for patients with end-stage MI, despite drug treatment guidelines that largely prolong the lifespan and reduce the mortality of MI patients. However, this approach is restricted by the lack of an adequate number of donors and the risk of tissue rejection. Recent research has concentrated on new alternatives, such as cardiac cellular myoplasty, which could potentially improve outcomes in terms of both and mortality and morbidity. A potential alternative treatment could be achieved by a tissue engineering (TE) approach, using a physical support, i.e. a scaffold, containing biomolecules capable of inducing specific cellular differentiation to generate an engineered cardiac construct. An initial challenge of generating an engineered cardiac patch is the development of the ideal biomaterial for cardiomyocyte culture. Researchers have proposed both synthetic and natural materials to generate a suitable cardiac graft. The development of three-dimensional (3D) fibrous networks as platforms for TE applications has been attracting considerable attention. Among several scaffolding options, hydrogel microfibers are particularly interesting for engineering high-cell-density 3D constructs. Also, they provide an open porous structure, which favors homogeneous perfusion of oxygen and nutrients throughout the entire structure, enhancing cell survival and tissue growth.Therefore, this work aimed to fabricate and characterize 3D cell-laden fibrous patches for myocardial regeneration. A simple coaxial flow wet-spinning system was used to prepare hydrogel fibrous structure using unmodified and RGD-pectin pectin for the first time. After process optimization, the effect of scaffold composition and architecture on the behavior of 3D-cultured myoblast was investigated. Materials and Methods For the fabrication of pectin-based fibrous patches two types of solution were initially prepared: the first with pure pectin (pect) and the second with pectin containing sucrose (pect-sacc). These solutions were injected into a wet-spinning set-up consisting of : i) a centrifugal pump for the circulation of the cross-linking solution containing calcium chloride (CaCl2);ii)a 20 mL syringe housed in a syringe pump and containing the pectin solution (and possibly cells) to be injected into the system; iii)silicone tubing, for the realization of closed loop for the circulation of the CaCl2 solution; iv)a polypropylene Y-connector, to inject polymer solution in the cross-linking solution circuit; v)a cell-strainer fitted in a 60 mL syringe for the collection of the fibres produced.For the optimization of the wet-spinning process the following parameters were evaluated: pectin concentration, molarity of the calcium chloride cross-linking solution and flow rate of the syringe pump. The scaffolds obtained were subjected to morphological characterization by optical microscopy and SEM analysis, to assess the influence of process parameters on fibre formation. To compensate for the lack of cell-adhesive sites in pectin molecules, (Glycine)4-Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine-Proline (RGD) sequence was grafted through the chemical conjugation method with carbodiimide. Also for this formulation (RGD-pect), the ideal parameters for the production of cohesive scaffolds have been identified. Then, optimized unmodified and RGD-grafted patches have been subjected to swelling and stability tests in PBS or in complete medium. Subsequently, preliminary encapsulation tests of murine fibroblasts (L929) were performed in bulk hydrogels and in microfibre to evaluate the cytocompatibility of materials and fabrication process. Finally, the encapsulation of murine myoblasts (C2C12), a preliminary cellular model for myocardial regeneration, was chosen to evaluate the cellular response to topographical (anisotropy) and chemical cues (RGD sequence). Specifically, comparative tests between unmodified and RGD-modified pectin was performed to evaluate metabolic activity, cell viability and cellular organization through Alamar Blue® assay, cell counting and immunofluorescence analysis, respectively. To further investigate the possibility of inducing a better maturation of encapsulated myoblasts and the formation of myotubes, a differentiation protocol was also applied. Results and Discussion After optimization of wet-spinning process, the parameters for realizing 3D microfibrous from both the pectin solutions were identified. Scaffolds fabricated with these parameters show uniform fibres in terms of morphology and diameter, with no appreciable defects. Dimensional analysis has shown that these fibres have an average diameter around 150 μm. SEM images confirmed the presence of a high interconnected porosity within the patches.The pectin modification process allowed the immobilization of 29.16 mg of RGD per g of pectin. For this formulation new fabrication parameters had to be identified, for the formation of cohesive 3D patches with uniform fibres, characterized by an average diameter equal to 202 ± 24 μm.Swelling of microfibres when immersed in the complete medium was superimposable for the two formulations regardless of chemical modification with RGD peptide and the different patch production conditions, in terms of concentration of material and calcium chloride molarity. Conversely, rapid dissolution occurred when the patches were aged in PBS.Preliminary encapsulation tests of L929 cells in bulk hydrogels made of pure and sucrose-containing pectin showed a better cytocompatibility for the first formulation, with a cell viability at 24h equal to 94 ± 4%. This material was then selected to perform encapsulation tests on L929 cells in microfibres, which confirmed both the cytocompatibility of the fabrication process and the maintenance of cell viability above 90% for prolonged culture times.The biological characterization of the microfibres with C2C12 cell embedded showed a better metabolic activity, proliferation and adhesion within the scaffolds made with RGD-modified pectin. After a double staining for nuclei and F-actin, it was possible to observe the presence of C2C12 cells attached to the matrices under a fluorescence optical microscope. Qualitatively, the cells appear elongated and present initial cellular spreading. Extended culture times allow alignment along the preferential direction imposed by the fibres. This phenomenon demonstrates the effectiveness of the structures produced: they can induce a specific orientation of encapsulated cells. On the other hand, myoblasts encapsulated in patches made with pure pectin maintain an almost constant metabolic activity, showing a spherical morphology, a qualitative index of poor adhesion to the hydrogel matrix, and release of cells for prolonged culture times.Finally, a preliminary differentiation test was carried out on C2C12 cells loaded in microfibres made with RGD-pectin. Myoblasts, treated after 3 days from encapsulation with a low FBS medium until the end of the culture, showed the ability to align and form myotubes, which were labelled with antibodies specific for sarcomeric myosin heavy chains. Conclusions According to the morphological analyzes carried out by optical microscopy and SEM it emerged that the simple and economical wet-spinning system is able to process different types of pectin in the form of uniform fibres, arranged in cohesive and manageable 3D patches. Specifically, the encapsulation of myoblasts, a preliminary cellular model used to perform in vitro studies of myocardial regeneration, has allowed us to verify a good response to topographical (fibre anisotropy) and chemical stimuli (RGD sequence). Furthermore, the application of a differentiation protocol allowed to further improve their spatial arrangement, determining the formation of myotubes. These results make it possible to consider the structures realized as a valid alternative to the current solutions in the scientific literature and represent a starting point for further and in-depth studies for applications in cardiac tissue regeneration.

Introduzione L’infarto del miocardio risulta la patologia cardiovascolare che colpisce maggiormente la popolazione mondiale in termini di morbidità e mortalità.Il trapianto cardiaco rimane il trattamento definitivo per i pazienti che raggiungono l’insufficienza cardiaca, stadio terminale della malattia, nonostante la definizione di linee guida per il trattamento farmacologico abbiano prolungato la durata della vita e ridotto la mortalità dei pazienti con scompenso cardiaco. Tuttavia, questo approccio è limitato dalla mancanza di un numero adeguato di donatori e dal rischio di rigetto del tessuto impiantato. Recenti ricerche si sono concentrate su nuove alternative, come la mioplastica cellulare cardiaca, che potrebbero potenzialmente introdurre miglioramenti in termini di morbilità e mortalità. Un potenziale trattamento alternativo potrebbe essere ottenuto mediante un approccio di ingegneria tissutale, utilizzando un supporto fisico, ossia uno scaffold, contenente biomolecole in grado di indurre una differenziazione cellulare specifica per generare un costrutto cardiaco ingegnerizzato. Una prima sfida di generare un patch cardiaco ingegnerizzato è lo sviluppo del biomateriale ideale per la coltura dei cardiomiociti. I ricercatori hanno proposto sia materiali sintetici che naturali per generare un graft cardiaco adatto. Lo sviluppo di reti fibrose tridimensionali (3D) come piattaforme per applicazioni ingegneria dei tessuti ha attirato notevole attenzione. Tra le varie opzioni per la realizzazione degli scaffold, le microfibre di idrogeli sono particolarmente interessanti per la progettazione di costrutti 3D ad alta densità cellulare. Infatti, questi forniscono un microambiente altamente idratato, insieme ad una struttura porosa aperta che favorisce la perfusione omogenea di ossigeno e nutrienti in tutta la struttura, migliorando la sopravvivenza delle cellule e la crescita dei tessuti. Pertanto, questo lavoro si è focalizzato sulla fabbricazione e la caratterizzazione di patch fibrosi carichi di cellule 3D per la rigenerazione del miocardio. Per preparare le microfibre a base di pectina pura e funzionalizzata con RGD è stato utilizzato un semplice ed economico sistema di wet-spinning. Dopo l'ottimizzazione del processo, è stato studiato l'effetto della composizione e dell'architettura dello scaffold sul comportamento dei mioblasti incapsulati all’interno. Materiali e Metodi Per la realizzazione di patch fibrosi a base di pectina sono state preparate inizialmente due tipologie di soluzione: la prima contenente pectina pura (pect) e la seconda pectina addizionata a saccarosio (pect-sacc). Queste soluzioni sono state iniettate in un set-up per wet-spinning costituito da:i)una pompa centrifuga per la circolazione della soluzione reticolante a base di calcio cloruro (CaCl2);ii)una pompa a siringa, nella quale viene alloggiata una siringa da 20 mL contenente la soluzione polimerica a base di pectina (ed eventualmente cellule) da iniettare nel sistema;iii)un connettore a Y in polipropilene, per la realizzazione del collegamento tra la linea idraulica dedicata alla circolazione della soluzione reticolante e la linea deputata all’iniezione nel circuito della soluzione polimerica;iv)tubi in silicone, per la realizzazione delle linee idrauliche per la circolazione della soluzione di CaCl2;v)una siringa cono catetere da 60 mL con alloggiato all’interno un cell-strainer, opportunamente adattato per la raccolta delle fibre prodotte. È stata eseguita un’ottimizzazione del processo di wet-spinning, durante il quale sono stati valutati i seguenti parametri: concentrazione della pectina, molarità della soluzione reticolante di calcio cloruro e portata della pompa a siringa. Gli scaffold ottenuti sono stati sottoposti a caratterizzazione morfologica mediante analisi di microscopia ottica e SEM, per valutare l’influenza dei parametri di processo sulla formazione delle fibre. Per sopperire alla mancanza di siti adesivi per le cellule nelle molecole di pectina, è stata effettuata la modifica chimica di questo materiale con l’oligopeptide (Glicina)4-Arginina-Glicina-Acido Aspartico-Serina-Prolina (RGD) tramite il metodo chimico di coniugazione con carbodiimmide. Anche per questa formulazione (RGD-pect) sono stati individuati i parametri ideali per la produzione di scaffold coesi. Successivamente, i patch ottimizzati a base di pectina pura e funzionalizzata sono stati sottoposti a prove di rigonfiamento e stabilità in PBS e mezzo completo. In seguito, sono state predisposte delle prove preliminari di incapsulamento di fibroblasti murini (L929) in idrogeli massivi e in microfibre per valutare la citocompatibilità dei materiali e del processo produttivo, rispettivamente. Infine, è stato effettuato l’incapsulamento di mioblasti murini (C2C12), modello cellulare usato per studi preliminari riguardanti la rigenerazione del miocardio. In particolare, è stata valutata la risposta cellulare a stimoli topografici (anisotropia) e chimici (sequenza RGD). Inoltre, è stato realizzato uno studio comparativo tra formulazione di pectina pura e modificata in termini di attività metabolica, vitalità cellulare e organizzazione cellulare attraverso saggio Alamar Blue®, conta cellulare e analisi di immunofluorescenza, rispettivamente. Per investigare più nel dettaglio la possibilità di indurre una migliore maturazione dei mioblasti incapsulati, con associata formazione di miotubi, è stato anche applicato un protocollo di differenziamento. Risultati e Discussione In seguito alla fase di ottimizzazione del processo di wet-spinning, sono stati individuati i parametri utili alla realizzazione di patch 3D microfibrosi a partire da diverse soluzioni a base di pectina. Le immagini ottenute al microscopio ottico degli scaffold ottenuti con questi parametri mostrano fibre uniformi in termini di morfologia e diametro, sostanzialmente prive di difetti. L’analisi dimensionale ha evidenziato che tali fibre presentano un diametro medio intorno ai 150 μm. Le immagini SEM hanno permesso di osservare la presenza di una elevata porosità interconnessa all’interno dei patch.Il processo di modifica della pectina ha consentito l’immobilizzazione di una quantità di peptide pari a 29.16 mg di RGD per g di pectina. Per questa formulazione sono stati individuati nuovi paramenti produttivi, utili alla formazione di patch 3D coesi con fibre uniformi caratterizzate da un diametro medio pari a 202 ± 24 μm. I test di rigonfiamento hanno mostrato che le microfibre non hanno alterato complessivamente il loro comportamento, quando immerse in mezzo completo, a fronte del processo di modifica chimica con peptide RGD e delle diverse condizioni di produzione dei patch, in termini di concentrazione di materiale e di molarità di calcio cloruro per le due formulazioni. Al contrario, una rapida dissoluzione si è verificata quando i patch sono stati posti a contatto con PBS. Le prove preliminari di incapsulamento delle cellule L929 in idrogeli massivi a base di pectina pura e addizionata con saccarosio hanno evidenziato una migliore citocompatibilità della prima formulazione, con una vitalità a 24h pari a 94 ± 4%. Questa tipologia di materiale è stata quindi selezionata per effettuare prove di incapsulamento delle cellule L929 in microfibre, che hanno confermato sia la citocompatibilità del processo produttivo sia il mantenimento della vitalità cellulare sopra il 90% per tempi prolungati di coltura. La caratterizzazione biologica delle microfibre con incapsulamento delle cellule C2C12 ha evidenziato una migliore attività metabolica, proliferazione e adesione all’interno degli scaffold realizzati con pectina modificata con RGD. A seguito di una doppia colorazione per nuclei e F-actina, è stato possibile osservare al microscopio ottico a fluorescenza la presenza delle cellule di linea C2C12 adese alle matrici idrogeliche. A livello qualitativo, le cellule appaiono allungate e presentano un buon livello di spreading cellulare iniziale. Tempi prolungati di coltura consentono l’allineamento lungo la direzione preferenziale imposta dalle fibre. Questo fenomeno dimostra la reale efficacia delle strutture prodotte: esse sono in grado di indurre una disposizione specifica nelle cellule che vi aderiscono. Di contro, i mioblasti incapsulati in patch realizzati con pectina pura mostrano una attività metabolica pressoché costante, con mantenimento di una morfologia sferica, indice di non adesione alla matrice idrogelica, e rilascio di cellule per tempi prolungati di coltura.Infine, è stata eseguita una prova preliminare di differenziamento delle cellule C2C12 inglobate in microfibre realizzate con RGD-pectina, che ha permesso di verificarne l’efficacia. I mioblasti, trattati dopo 3 giorni dall’incapsulamento con un mezzo a basso contenuto di FBS fino al termine della coltura, hanno mostrato la capacità di allinearsi e formare miotubi, evidenziati dalla marcatura con anticorpi specifici per le catene pesanti di miosina sarcomerica. Conclusioni Dalle analisi morfologiche effettuate mediante microscopia ottica e SEM è emerso che il semplice ed economico sistema di wet-spinning è in grado di processare diverse tipologie di pectina sottoforma di fibre uniformi, arrangiate in patch 3D coesi e maneggevoli. In particolare, l’incapsulamento di mioblasti di linea, modello cellulare preliminare impiegato per effettuare studi in vitro di rigenerazione del miocardio, ha consentito di verificare una buona risposta a stimoli topografici (anisotropia delle fibre) e chimici (sequenza RGD). Inoltre, l’applicazione di un protocollo di differenziamento ha consentito di migliorare il loro arrangiamento spaziale, determinando la formazione di miotubi. Questi risultati permettono di considerare le strutture realizzate una valida alternativa alle soluzioni presenti nella letteratura scientifica e rappresentano un punto di partenza per ulteriori e approfonditi studi per applicazioni nella rigenerazione del tessuto cardiaco.