Modifica morfologica su scala nanometrica del titanio per l'implantologia odontoiatrica

Titanium and titanium alloys are one of the most used implant materials for biomedical applications due to their outstanding properties, including high biocompatibility, resistance to body fluid exposure, great tensile strength, flexibility and high corrosion resistance (1). The clinical success of oral implants is related to their early osseointegration with the forming tissue. Cell and bacteria adhesion on the prosthesis is influenced by surface properties, combined with charge distribution and material chemistry. With the aim to improve the osseointegration, decrease bacterial adhesion and inflammatory response, and to avoid the foreign body response, tissue engineer, and nanotechnology researchers developed different techniques for implants surface modification (2). Treatments, such as titanium plasma-spraying, grit-blasting, acid-etching, anodization or calcium phosphate coatings are some of the most studied processes (3,4). Among these treatments, the anodization process has attracted attention of several researchers thanks to its simplicity and its reproducible and controllable results (5). This technique allows the generation of nanotextured morphologies; the surfaces are uniformly covered by ‘nanopits’ that give optimal results in terms of cellular adhesion and antibacterial properties. (6-8). The knowledge of how bacteria and cells react to topography is still not a clear question; recently some works reported that some topography factors such as dimension, shape, and geometrical arrangement could strongly influence the bacterial and cellular behaviour in terms of adhesion, proliferation and differentiation. The bacterial behaviour is also related to the bacteria typology, in fact, different kind of bacteria could demonstrate different behaviour on the same surface (9-11). The roughness, identified with the parameter Ra, and the contact angle play a crucial role in terms of bacteria reaction. The results found in literature are often less comparable due to the fact that there are different factors coming into play and contributing to a wide range of bacteria behaviour, such as the possibility to choose different kind of cells or bacteria for this application or, also, the difference between the results in vivo and in vitro. However, it is possible to define a range of roughness values that could be considered more appropriate for the cells and bacteria. Different works showed how on smooth surface occurs a less bacteria adhesion compared to rough surface in terms of microroughness (12,13). For nano-roughness, values under 20nm, are considered good for the application (14). For the contact angle, the choice between hydrophilic or hydrophobic surface depends also to the physical-chemical properties of bacteria; in fact hydrophilic bacteria, for example, tend to adhere easily on hydrophilic surfaces (15). For this reason it is difficult to achieve an uniformity of results. Cells adhesion is strongly influenced by the dimension of nanotubes diameter generated by anodization process. Optimal results are among 50-70nm 70nm (16,17). The aim of this work is the realization of a titanium nanotextured morphology using anodization in order to achieve antibacterial properties. Then, the surface will be tested to be applied in the abutment zone of a dental implant. To obtain the nanotextured surface we have carried out short time anodization process, under 15 minutes, to avoid the generation of too long tubular structure. In this way we have obtained surfaces covered by ‘nanopits’ with parameters comparable with other antibacterial surface in literature in terms of roughness and contact angle. The anodization took place with electrolytic solution, voltage, and intensity of electrical current obtained by a previous work. The anodization process was set with a different time, to verify if there would be any differences with regards to morphology in terms of roughness and contact angle, keeping in mind the range found in the literature. After the surface characterisation, we have chosen a unique treatment duration, according to the values in the literature, that, in contact with the gums, could obstruct the bacteria adhesion and in the same time could guarantee a better cellular adhesion. After that, we carried out a heat treatment on this unique kind of sample in order to obtain a modification of crystalline phase that could be advantageous to our application (44,45) and finally we performed microbiological and cellular test. The anodization process has been performed in an electrolyte based on ethylene glycol; this solution had the following composition: 1L ethylene glycol, 5.5 M H2O and 0.5% wt. of NH4F. The voltage was 70V and the intensity of the current was 20mA. It is reported in the literature that the nanotubes diameter is strictly connected to the voltage value (18), and a voltage value of 70V resulted sufficient for our application. For the experiments we have used titanium grade 2 disks (Titalia). Table 1 demonstrates four kinds of samples: The samples obtained in 4 different anodization time frames were characterized with scansion electronic microscope (SEM), laser profilometry, atomic force microscope (AFM), contact angle, X-ray diffraction (XRD). Microbiologic tests were performed with two different strains of bacteria: P. gingivalis DSM 20709 and aggregatibacter DSMZ 11123, both participating in oral cavity infections, especially in periodontitis (19,20). Human gingival fibroblast (HGF) were used for cytocompatibility tests. The results obtained with SEM analyses showed that there is a difference in the length of nanotubes passing from 5 to 10 minutes, while from 10 to 15 minutes no significant difference has been observed. The graph in figure 1 shows the length of nanotubes respectively to time. Figure 2 shows the SEM images where it is possible to see the different length of nanotubes: The images show the surface topography and the different nanotubes length. Table 2 demonstrates Ra and Rz parameters for the 4 samples. Analysing the roughness results obtained by laser profilometry it has been noticed that the lowest values of Ra and Rz are for the samples Ti-10min and Ti-15min. This could be explained by the fact that a more complete nanotube structure for the higher duration of processes cause a surface flattening. For the nano-roughness parameters a clear decrease of Sa parameter passing from Ti-2min and Ti-10min can be observed. This could be explained by a surface levelling passing from nanopits, generated after 2 minutes, to nanopores, generated after 5 minutes, and to nanotubes, generated after 10 minutes. This fact is clearly visible in 3D AFM images in figure 3 where there is a comparison between Ti-2min and Ti-10min: Wettability tests has shown increase in hydrophobic surface with the anodization time. Table 3 demonstrates the contact angle results: In figure 4 is shown the difference between n.t., Ti.2min and Ti-15min: Based on the obtained results we were looking for a sample with a morphology characterized by a a uniform distribution of nanopores over the surface, a morphology with parameters of roughness within the optimal range to guarantee antibacterial properties, and a hydrophobic surface. The sample Ti-10min and Ti-15min resulted in having similar properties to the ones we were looking for. Finally, as differantiation between these two samples, we considered the shorter time as an advantage in a production process. Therefore, we chose Ti-10min to perform microbiologic and cellular tests preceded by a thermal treatment to verify anatase crystalline phase generation that, from literature, results to be adapted in term of no-adhesion bacteria (21) and osteointegration (22). Figure 5 shows as Ti-10min tt sample presenting peaks in correspondence with anatase phase, while Ti-10min presents peaks in correspondence with titanium and titanium oxide: Results of specimens’ antibacterial adhesion evaluation are reported in Figures 6 for A. actinomycetemcomitans (AA) and P. gingivalis (PG), after 1h and 2h of direct contact between bacteria and sample. A decrease of bacteria number of about 1 log (CFU) has been verified comparing n.t. and Ti-10min tt.. This difference can be considered significant (p<0.05) after 2h for PG. Results of specimens’ in vitro cytocompatibility evaluation towards human primary gingival fibroblasts (HGF) are reported in Table 4. The means has been normalized towards untreated specimen. Metabolism has increased, as shown in table 4: We can conclude that the anodization process on titanium, however generally it is used for generating long nanotubes, if it is performed over a short period of time it is possible to obtain an antibacterial morphology. The advantage of this study is the fact that we have obtained a morphology with antibacterial properties through an easy, time effective, easily reproducible and cheap process; all these characteristics make this process adapt to an industrial level. It will be interesting for the future to investigate, with a proteomic study, the cellular sensing mechanisms that led to the results we obtained and, in this way, to see if, and how, given morphology influenced determined protein synthesis by bacteria and cells.

Il Titanio e le sue leghe sono tra i materiali più utilizzati in ambito biomedico grazie alle loro caratteristiche, come l’elevata biocompatibilità, la resistenza all’aggressività dell’ambiente biologico, la grande resistenza alla trazione e corrosione e, infine, la flessibilità (1). La fissazione ottimale di un impianto dentale è strettamente legata alla sua osseointegrazione con il tessuto neogenerato durante le prime fasi della guarigione oltre che alla assenza di reazioni infiammatorie dovute all’insediamento di batteri. L’adesione batterica e cellulare sulla superficie di un dispositivo è influenzata da molti fattori tra cui le proprietà superficiali dell’impianto, la distribuzione di carica e la chimica superficiale del materiale. Con lo scopo di migliorare l’osteointegrazione, diminuire l’adesione batterica e la risposta infiammatoria, e per evitare una risposta immunitaria, sono stati sviluppati differenti tecniche per la modifica della superficie dei dispositivi in titanio (2). Trattamenti superficiali come titanio plasma-spraying, sabbiatura, acid-etching, anodizzazione e rivestimenti di calcio fosfato sono alcuni dei processi più studiati (3,4). Tra questi, il processo di anodizzazione, che porta alla generazione di nanotubi sulla superficie, ha attratto l’attenzione di numerosi ricercatori grazie alla sua facilità di processo e ai risultati facilmente controllabili e riproducibili (5). Attraverso questa tecnica è possibile creare morfologie nanotextured; le superfici risultano ricoperte uniformemente da ‘nanopozzetti’ che danno ottime risposte in termini di adesione cellulare e non adesione batterica. (6-8). La conoscenza di come batteri e cellule reagiscono alla topografia è una questione ancora non pienamente chiara; recentemente alcuni studi hanno permesso di fare passi avanti riguardo al fatto che alcuni fattori topografici quali la dimensione, la forma, e l’arrangiamento geometrico possono fortemente influenzare il comportamento batterico e cellulare come l’adesione, proliferazione e differenziazione. La risposta batterica alla topografia dipende anche dalla tipologia di batterio e quindi batteri differenti rispondono diversamente ad uno stesso substrato ma comunque qualsiasi tipologia di batterio è sempre influenzato da una diversa topografia (9-11). I parametri morfologici che più influenzano la risposta batterica e cellulare sono la rugosità, identificata con il parametro Ra e l’angolo di contatto. Da letteratura sono stati trovati risultati spesso poco confrontabili in termini di rugosità e angolo di contatto per il fatto che entrano in gioco diversi fattori che contribuiscono ad una grande variabilità di risposta batterica e cellulare tra cui anche la vasta possibilità di cellule o batteri che si possono scegliere per questo tipo di applicazione o anche la differenza di risultati tra prove in vitro e prove in vivo. E’ possibile comunque arrivare a definire un range di valori in termini di rugosità che garantiscono una risposta ottimale di cellule e batteri. Diversi lavori hanno dimostrato come su superfici più lisce si sia verificata minor adesione batterica rispetto a superfici più rugose per quanto riguarda la microrugosità (12,13). In termini di nanorugosità, valori sotto i 20nm, sono da considerare consoni all’applicazione (14). Per quanto riguarda l’angolo di contatto, la scelta dell’utilizzo di una superficie idrofobica o idrofilica dipende anche dalle proprietà chimico-fisiche del batterio quindi risulta più difficile trovare un’uniformità di risultati (15). L’adesione cellulare risulta essere fortemente influenzata dalla dimensione del diametro dei nanotubi formati dal processo di anodizzazione. Valori ottimali risultano essere tra i 50-70nm (16,17). Questo lavoro, che si inserisce all’interno di questo ambito di ricerca, ha come scopo dunque la lavorazione di una superficie in titanio, tramite un processo di anodizzazione, per ottenere una morfologia nanotextured che abbia proprietà antibatteriche, con l’obiettivo, una volta testata, di poter essere applicata nella zona del colletto di un impianto dentale, zona più a rischio di infezione batterica. Si è arrivati all’ottenimento della superficie nanotextured desiderata attraverso processi di anodizzazioni di breve durata, ovvero al di sotto di 15 minuti, durata oltre la quale si ha formazione di strutture tubolari, come si evince da letteratura, e non adatte a questa applicazione; in questa maniera invece si sono ottenute superfici ricoperte da ‘nanopozzetti’ con parametri di caratterizzazione superficiale confrontabili con superfici antibatteriche già presenti in letteratura in termini di rugosità e angolo di contatto. Sono state eseguite prove sperimentali utilizzando soluzione elettrolitica, tensione e intensità di corrente ricavati da un lavoro svolto in precedenza. Sono stati settati diversi tempi di durata del processo di anodizzazione, rimanendo sempre sotto i 15 minuti, per verificare se ci fossero differenze sostanziali sulla morfologia in termini di parametri di rugosità, profondità dei solchi e angolo di contatto, tenendo sempre in considerazione i range di valori ricavati da letteratura per l’applicazione finale. Successivamente alla caratterizzazione delle superfici così ottenute è stato scelto un'unica durata di trattamento, in base alle informazioni ricavate da letteratura, che, a contatto con la gengiva, ostacolasse l’adesione batterica e allo stesso tempo garantisse una migliorare adesione cellulare. Dopo di che su questa unica tipologia di campione è stato eseguito un trattamento termico in modo da ottenere una modifica della fase cristallina che possa portare vantaggi in relazione alla nostra applicazione (44,45) e infine sono state eseguite le prove microbiologiche e cellulari. Il processo di anodizzazione del titanio è stato condotto in un elettrolita a base di glicole etilenico; tale soluzione aveva la seguente composizione: 1L di glicole etilene, 5.5 molare di H2O e 0.5% wt. di NH4F. Per quanto riguarda la tensione e l’intensità di corrente è stato scelto rispettivamente il valore di 70V e 20mA. Da letteratura infatti è noto come la dimensione del diametro dei nanotubi sia strettamente correlato al valore di tensione impostato (18), ed una tensione di 70V è risultata consona alle dimensione ricercate per l’applicazione. Per gli esperimenti sono stati utilizzati dischetti in titanio grado 2 (Titalia). In tabella 1 sono riportate le 4 tipologie di campioni testate: Campioni Tempo di trattamento Campione1 2 minuti Campione2 5 minuti Campione3 10 minuti Campione4 15 minuti Tabella 1 Differenti tempi di trattamento I campioni ottenuti con 4 diversi tempi di anodizzazione sono stati caratterizzati tramite Microscopio elettronico a scansione (SEM), profilometria laser, microscopio a forza atomica (AFM), angolo di contatto, diffrazione ai raggi X (XRD). Le prove microbiologiche sono state effettuate testando due tipologie di batteri: il P. gingivalis DSM 20709 e l’aggregatibacter DSMZ 11123, entrambi presenti nelle infezioni della cavità orale, soprattutto nella parodontite. Da letteratura risulta che questa tipologia di batteri tenda ad aderire più facilmente su superfici idrofiliche (19,20). Per i test di citotossicità si è utilizzato le Human gingival fibroblast (HGFs). I risultati ottenuti al SEM mostrano come ci sia una differenza in lunghezza dei nanotubi passando dai 5 ai 10 minuti di trattamento, mentre da 10 a 15 minuti non si notano cambiamenti in lunghezza significativi. Il grafico in figura 1 mostra l’andamento temporale della lunghezza dei nanotubi, in figura 2 sono mostrate le immagini al SEM che evidenziano i diversi spessori dei nanotubi. Figura 1 Differenze in termini di lunghezza tra i 4 campioni Figura 2 Immagini al SEM rispettivamente del campione Ti-2min,Ti-5min, Ti-10min, Ti-15min. Le immagini mostrano i diversi spessori e la topografia superficiale Dai risultati di rugosità ricavati da profilometria si nota come per i tempi maggiori risultino valori di Ra e Rz più bassi rispetto ai tempi minori. Ciò potrebbe essere spiegato dal fatto che la più completa formazione del nanotubo nelle tempistiche maggiori porti ad un generale appiattimento della superficie. In tabella 2 sono riportati i valori: Ti-2 min Ti-5 min Ti-10 min Ti-15 min n.t. Ra [nm] 430±75 373±13 425±27 334±18 317±30 Rz [nm] 2808±507 2337±136 2809±213 2306±147 2301±221 Tabella 2 valori di Ra e Rz per i camioni trattati e non trattato Per i parametri di nanorugosità si ha una netta diminuzione di questi parametri passando da Ti-2min a Ti-15min. Ciò può essere interpretato come un livellamento della superficie del dischetto man mano che si ha il passaggio dai pozzetti, che si creano dopo 2 minuti di anodizzazione, ai nanopori, che si hanno dopo 5 minuti, ai nanotubi che cominciano a formarsi dai 10 minuti in poi. Ciò è ben visibile nelle immagini 3D dell’AFM in figura 3 che mostrano le differenze tra Ti-2min e Ti-10min: Le prove di bagnabilità hanno evidenziato un aumento di idrofobicità delle superfici all’aumentare del tempo di anodizzazione. In tabella 3 sono presenti i risultati di angolo di contatto: Ti-2min Ti-5min Ti-10min Ti-15min n.t. Angolo di contatto [°] 70.4±4.6 85.3±4.6 90.4±6.3 94.4±3.3 66.3±4.3 Tabella 3 Angolo di contatto per i 4 campioni In figura 4 è visibile la differenza di angolo di contatto della goccia d’acquasulla superficie dei campioni n.t., Ti-2min e Ti-15min: Figura 4 Immagini della goccia d’acqua sulla superficie; differenza tra (da sinistra) n.t., Ti-2min e Ti-15min. Si è così selezionato un campione con una morfologia caratterizzata da una distribuzione omogenea dei nanopori su tutta la superficie, una morfologia i cui parametri di rugosità rientrassero in un range ottimale per garantire proprietà antibatteriche, e una superficie con proprietà idrofobiche. I campioni Ti-10min e Ti-15min sono risultati avere proprietà più simili a quelle ricercate. Infine come discriminante tra questi due campioni è stato considerato il tempo minore come vantaggio in un processo di produzione. Il campione Ti-10min è stato dunque selezionato per eseguire le prove microbiologiche e cellulari precedute da un trattamento termico per verificare la formazione di fase cristallina anatasio che da letteratura risulta essere più adatta in termini di non adesione batterica (21) e osteointegrazione (22). I diffrattogrammi in figura 5 mostrano come il campione Ti-10min t.t. presenti picchi in corrispondenza della fase cristallina anatasio, invece il Ti-10min presenta esclusivamente picchi in corrispondenza di titanio e ossido di titanio: Figura 5 Diffrattogrammi (da sinistra) del campione Ti-10min t.t. e del campione Ti-10min I risultati di valutazione di adesione antibatterica sono riportati in figura 6 rispettivamente per actinomycetemcomitans (AA) e P. gingivalis (PG) dopo 1h e 2h di contatto diretto tra batterio e campione: Figura 6 Conta delle colonie formanti unità (CFU) di P. gingivalis (PG) e A. actinomycetemcomitans (AA) dopo 1h, 2h. Dai grafici risulta come si sia verificato una diminuzione del numero di batteri (CFU) di 1 log comparando il n.t. e il Ti-10min tt, differenza che risulta essere significativa (p<0.05) dopo 2h per il PG. I risultati di valutazione di citocompatibilità in vitro con cellule umane primarie fibroblasti gengivali (HGF) sono riportati in tabella 4; le medie sono state normalizzate rispetto al campione n.t.. Dai risultati si può notare come il metabolismo cellulare sia aumentato: (campioni) 24 h (vs n.t.) 48 h (vs n.t.) 72 h (vs n.t.) Ti-10min 58.39 % 29.09 % 15.40 % Ti-10min tt 77.76 % 39.03 % 22.56 % Tabella 4 Aumento del metabolismo cellulare (%) rispetto al campione non trattato (n.t.) (considerato come 100%). I risultati dei test microbiologici e cellulari hanno mostrato come la morfologia porta a buoni risultati specialmente in termini di non adesione batterica dopo 1h e 2h di contatto dei batteri con il campione; risulta minore la differenza dopo le 24h non essendoci un’attività battericida. Le cellule risultano adattarsi senza problemi al substrato. I miglioramenti verificati comparando i campioni Ti-10min e Ti-10min tt non sono considerati significativi. Si può concludere che il processo di anodizzazione su titanio, nonostante sia di più largo uso per la generazione di lunghi nanotubi da utilizzare come reservoir, attuato su tempi relativamente brevi possa portare ad una modifica morfologica che, dai risultati ottenuti, porta ad avere proprietà antibatteriche. Il punto di forza di questa sperimentazione è stato quello di aver ottenuto una morfologia con proprietà antibatteriche attraverso un processo semplice, di breve durata, facilmente riproducibile e a basso costo, tutte caratteristiche che lo rendono potenzialmente adatto ad un utilizzo a livello industriale. Alla luce dei risultati delle prove microbiologiche, in futuro ci si potrà concentrare, con uno studio di proteomica, su quali siano i meccanismi di sensing cellulare che hanno portato a determinati risultati e quindi andare a vedere se e come la morfologia creata abbia influenzato la specie biologica alla sintesi di determinate proteine.