Bioreactor-based engineered liver systems for disease modeling

Liver disease accounts for 2 million deaths per year worldwide. Liver fibrosis represents an inflammatory state resulting from liver injury, where excessive extracellular matrix (ECM) is produced by activated hepatic stellate cells (HSCs) compromising anatomy and function of the liver. This condition can evolve into cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The gold standard treatment for end-stage liver disease is transplantation, but it is associated with severe limitations, such as organ availability and immune-suppressive therapy. Therefore, new therapeutic strategies are required and since recent findings have shown reversibility of the fibrogenic mechanism, new approaches consist in targeting liver fibrosis progression to avoid a more chronic uncontrolled wound healing process. This work describes the development of bioreactor systems to support the generation of humanized 3D bioengineered liver tissues that recapitulate features of liver fibrosis, combining decellularized scaffolds, patient-derived HSCs and circulating immune cells (peripheral blood mononuclear cells - PBMCs) and chemical and mechanical signals using tissue engineering technology. Two bioreactors were optimized and produced: a bioreactor for whole-liver perfusion and culture (the WL) and a bioreactor to culture smaller scaffolds, increasing numerosity and decreasing the amount of media and cells used per experiment (the Poppins). A perfusion decellularization process was used to generate a rat whole-liver scaffold, which showed preservation of the vasculature network and the ECM architecture of the native organ. The vascular access was used to repopulate scaffolds with HSCs and to maintain the seeded scaffold in dynamic culture conditions for up to 6 days, achieving higher cell infiltration and activation to a fibrotic state compared to static culture conditions and conventional 2D cultures. The bioreactor systems also supported dynamic perfusion of PBMCs, producing circulation of live immune cells through the vasculature of the decellularized scaffold. Effects of fluid-dynamic stress and viscosity on cell viability and phenotype were tested to identify the best dynamic culture conditions. These results suggested that the bioreactors represent relevant tools to support 3D cultures to generate bio-engineered liver disease models.

Le malattie epatiche causano 2 milioni di morti all'anno in tutto il mondo. La fibrosi epatica é caratterizzata da uno stato infiammatorio derivante da un danno a carico del fegato: ció innesca l’attivazione delle cellule stellate, che provoca una sbilanciamento nel processo fisiologico di turn-over della matrice extracellulare verso una sintesi eccessiva. Questa sovra-produzione incontrollata compromette l’architettura e la funzionalità del fegato. Se il danno persiste nel tempo, lo stadio fibrotico puo’ evolvere in cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare. Nonostante, dal punto di vista terapeutico, il trapianto di fegato sia il gold standard per le patologie epatiche in stadio avanzato-terminale, questo approccio chirurgico é caratterizzato da due gravi limitazioni: la ridotta disponibilitá di organi e la necessitá di una costante terapia immunosoppressiva. Risulta quindi di vitale importanza lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per le malattie epatiche. Poiché recenti studi hanno dimostrato una possibile regressione del processo fibrogenico, nuovi approcci mirano direttamente alla reversione o al blocco della fibrosi come obiettivo chiave per rallentare od evitare la progressione della patologia verso condizioni croniche. Lo scopo di questo lavoro di tesi é lo sviluppo di due bioreattori in grado di supportare la generazione di un tessuto epatico tri-dimensionale (3D) bioingegnerizzato, che mimi le caratteristiche più importanti della fibrosi epatica. Tramite un approccio di ingegneria tessutale, questo modello di malattia epatica é stato realizzato combinando scaffold ottenuti da decellularizzazione di fegati di ratto, cellule stellate derivate da pazienti, cellule immunitarie da sangue periferico da pazienti (peripheral blood mononuclear cells - PBMCs) e specifici segnali di natura chimica e biomeccanica. Nello specifico, gli obiettivi di questo studio sono stati lo sviluppo e ottimizzazione di due bioreattori: un bioreattore per la perfusione dinamica e coltura dell’intero organo epatico (WL bioreactor) e un bioreattore per la perfusione e coltura di scaffold di ridotte dimensioni (Poppins bioreactor). Quest’ultimo risponde alla necessitá di ridurre la quantitá dei reagenti e delle cellule utilizzati, aumentando allo stesso tempo la numerositá dei replicati e dei parametri testabili per eperimento. Lo scaffold utilizzato per lo sviluppo del tessuto 3D bioingegnerizzato é stato ottenuto tramite un processo di decellularizzazione per perfusione di fegati di ratto, con cui é possibile rimuovere la componente cellulare conservando la rete vascolare e l'architettura della matrice extracellulare dell'organo nativo. Il network vascolare è stato sfruttato come accesso sia per la ripopolazione dello scaffold con cellule stellate, sia per realizzare una coltura dinamica del costrutto fino a 6 giorni. La coltura dinamica ha promosso una piu` efficace infiltrazione e distribuzione delle cellule all’interno dello scaffold rispetto alle coltura statica. La coltura dinamica si é dimostrata inoltre superiore nel riprodurre tratti caratteristici della fibrosi epatica: la perfusione prolungata ha indotto una significativa attivazione nelle cellule stellate, corrispondente ad uno stato fibrotico che non risulta essere riproducibile nelle convenzionali colture statiche e bidimensionali. Inoltre, i bioreattori sviluppati hanno supportato la perfusione dinamica di cellule immunitarie (PBMCs), cellule che fisiologicamente circolano nell’organismo e non necessitano di un substrato a cui aderire. L’impatto dello stress fluidodinamico e della viscosità sulla vitalità cellulare e sul fenotipo delle PBMCs é stato analizzato testando diversi parametri, per identificare le migliori condizioni di coltura dinamica. I risultati ottenuti hanno evidenziato che i bioreattori prodotti in questo lavoro di tesi rappresentano strumenti essenziali per supportare lo sviluppo e l’utilizzo di tessuti 3D bioingegnerizzati per lo studio di stadi patologici della fibrosi epatica.