Production and evaluation of biocompatibility of polyacrylonitrile and carbon fibers

Nanoparticles composed of metallic materials, called multimetallic particles, are a new technology with a wide range of interesting applications including: catalysis, energy storage, bio-imaging and other applications in the biomedical field. In fact, being able to combine multiple metallic elements in a single particle, at the nanoscale, offers the possibility of obtaining materials with properties that could exceed those of nanoparticles composed by a single metallic element known as "Singlemetallic Nanoparticles". The current approaches for the preparation of multimetallic nanoparticles derive from classical chemistry to obtain metal alloys through which it is possible to reach a variety of different sizes, shapes and phases in a single compound. However, most studies with classical chemical methods, such as fusion, report compositions of alloys made by no more than three elements, considerably limiting the degree of complexity of the final product. Furthermore, resizing particles at the nanoscale is complex, especially with conventional alloying methods. Therefore, the development of a synthesis method in which the elemental composition, the size and phase of the particles can be precisely controlled could lead to a new repertoire of alloys and nanostructures with unprecedented functionality. In fact, the objective is to obtain separate non-phase nanoparticles, or defined as low entropy, but one with a more homogeneous phase or higher entropy (Figure 1). From a group of American researchers [12] a rather simple method of two-phase carbothermal shock was developed which uses the heating and the subsequent rapid cooling of carbon fibers, loaded with metal elements, which are used as a support for the production of alloy nanoparticles with a maximum of eight different elements (Figure 2).  Once the synthesis of the particles has taken place, until now, it is very difficult  to separate them from the support through which they were obtained; therefore, to evaluate the biocompatibility and the possible application in the biomedical field the particles must be tested directly on the carbon fibers.  The ultimate goal of the present thesis work is the production by electrospinning of the polyacrylonitrile fibers (PAN), the subsequent carbonization of them and after having carried out a dimensional characterization of the obtained fibers, the biocompatibility has been evaluated by in vitro tests, performed both on electrospun matrices in PAN and carbon ones.   The final objective is to obtain the degree of toxicity of the support used to obtain metallic nanoparticles which can strongly influence the behavior of these latter. The work done is presented briefly in the conceptual map in Figure 3.Chapter 1 introduces the reader to the topic of carbon fibers; a brief historical excursus presents them with their applications used today and currently on the market. The versatility of the material and the products obtainable allow the application of the fibers in many different and heterogeneous fields; currently in the biomedical field, prosthetic products formed from carbon and carbon fibers are on the market thanks to their main properties, such as low weight and high mechanical strength. The chapter also pays attention to another characteristic of carbon fibers which, in the biomedical field, assumes fundamental importance, namely their biocompatibility. In fact, although carbon- based products have been on the market for years thanks to their unquestionable and considerable mechanical properties, their biocompatibility is still discussed and controversial. For this reason, the work done investigates the toxicity of the carbon fibers produced. Chapter 2 describes the very versatile technique of electrospinning (Figure 5) through which it is possible to obtain polymeric fibers with nanometer diameter. In detail, the fundamental characteristics of this technique and the components of the experimental setup are presented (Figure 6). Furthermore, particular attention has been paid to the polymer drop formation, mechanism of the fiber elongation, to the fiber instability region and to the solvent evaporation process. Subsequently, a theoretical model is presented, which describes the electrospinning technique and many parameters that influence the type, morphology and diameter of the fibers and they are exhaustively analyzed. Finally, some examples of the areas in which fibers with nanometer diameter are used or are in the research phase are presented.  Chapter 3 deals with the laboratory activity aimed at the effective production of PAN-based filaments (Figure 7) and their consequent carbonization to obtain carbon fibers; in detail, the technical and experimental parameters chosen to obtain PAN fibers are presented; subsequently, the carbonization process is described and how the matrices with carbon fibers were obtained ( Figure 8). SEM analyzes of both PAN and carbon fibers have been carried out through the Open Source Software Fiji, the most popular software plugin Imaj, the diameter has been evaluated by measuring 150 PAN fibers and 150 carbon fibers. The average value of the diameter of the PAN fibers is 633 nm while for the carbon fibers it is 875 nm. Chapter 4 describes the work carried out in the class 2 biological laboratory and presents the in vitro biological tests carried out through which it was possible to evaluate the toxicity of the materials produced. Specifically, the chapter begins with a description of the types of fibroblasts used (i.e. NIH 3T3) for testing and NIH 3T3 cell proliferation tests. In fact, this value is indicative of cellular quality and vitality. Subsequently, are described the cytotoxicity tests carried out using the eluate placed in contact with the PAN fibers and for the same period of time with the carbon fibers. Three different concentrations were evaluated:   - ∂ = 50 mg / ml   - ∂ = 100 mg / ml   - ∂ = 500 mg / ml   Cell viability was evaluated by 3- bromide (4,5-dimethylthiazol-2 -yl) -2,5- diphenyltetrazoliocolorimeter (MTT assay). Given the results of low cell viability in indirect tests, qualitative tests of cell viability were carried out in tests of direct contact of 3T3 cells with the substrate. Through staining with DAPI it was possible to qualitatively evaluate the adhesion and vitality of the cells on the fibers. After obtaining positive results on cell survival in qualitative direct tests with DAPI, cell viability was evaluated, on PAN fibers and Carbon fibers, through the quantitative MTT assay. Furthermore, an evaluation of cell adhesion was carried out both on PAN fibers and on Carbon fibers by SEM scanning (figures 12). The results of both indirect and direct tests conducted for 1, 3 and 7 days of contact between cells and eluate (in indirect tests) or cells and electrospun fibers (in direct tests) were not entirely positive on cell viability at direct contact with carbon fibers. In fact, even in indirect tests, cell viability is strongly influenced after 7 days with increasing concentration of fibers left in contact with the eluate. The results show that the culture medium left in contact with the carbon fibers always has a more toxic behavior towards the cells than the one in contact with the fibers of PAN (an example is shown in Figures 13 and 14) as confirmed by the statistical tests performed (data normality test, Anova test and t-Student test) to analyze the behavior of cell viability values.  In chapter 5, concerning future developments, possible changes are suggested to be made to improve the methodologies for obtaining more biocompatible carbon fibers. In fact, from the results obtained it can be stated that both vitality and cellular behavior are not particularly influenced by contact with PAN fibers, whereas they are strongly affected by contact with carbon fibers. In detail, even after only 24 hours of direct contact with the latter, the vitality is greatly reduced. It is suggested, therefore, to carry out a superficial analysis of the fibers with the characterization of the elements present on surface through, for example, the infrared spectroscopy technique. Following the superficial analysis of fibers, washing and cleaning procedure is recommended through sonication, in order to eliminate all those processing residues that have been hypothesized as the main causes that have strongly influenced cellular behavior. The proposed technique is easily usable in the laboratory without the need for very expensive instruments and allows to obtain a deep cleaning of the treated materials (figures 17). Finally, a second superficial infrared analysis is suggested so that the presence or absence of the elements found on the surface before cleaning can be verified. After the washing procedure it is proposed to carry out in vitro biological tests again to assess that the suggested measures are actually aimed at obtaining more biocompatible carbon fibers. In chapter 6, the conclusions of the work are carried out and the evaluation of the in vitro biological compatibility of the considered materials are reported. It is also stated that any test of viability and cellular behavior of any material or nanoparticle in direct contact with carbon fibers cannot lead to reliable results due to the high toxicity of the fibers themselves. From the results obtained from the work performed, it can be concluded: - PAN fibers have for: 1 day of contact a slight cytotoxic behavior; 3 days of contact moderate cytotoxic behavior; 7 days of contact moderate cytotoxic behavior;   - the carbon fibers have for: 1 day of contact a severe cytotoxic behavior; 3 days of contact a severe cytotoxic behavior for; 7 days of contact complete cytotoxic behavior (no cell was more alive) Due to results, it is suggested a chemical surface investigation of carbon layers and a technical cleaning procedure to make them more biocompatible.

Le nanoparticelle composte da materiali metallici, chiamate particelle multimetalliche, sono una nuova tecnologia con una vasta gamma di interessanti applicazioni tra cui: catalisi, accumulo di energia, bio-imaging ed altre applicazioni in campo biomedico. Infatti, poter unire più elementi metallici in una singola particella alla nanoscala offre la possibilità di ottenere materiali con proprietà che potrebbero superare quelle di nanoparticelle composte da un singolo elemento metallico note come “Singlemetallic Nanoparticles”.   Gli approcci attuali per la preparazione delle nanoparticelle multimetalliche derivano dalla chimica classica per ottenere leghe metalliche attraverso la quale è possibile raggiungere una varietà di dimensioni, forme e fasi diverse in un singolo composto. Tuttavia, la maggior parte degli studi con metodi chimici classici, come ad esempio la fusione, riporta composizioni di leghe non superiori a tre elementi, limitando notevolmente il grado di complessità del prodotto finale. Inoltre, ridimensionare le particelle su scala nanometrica risulta complesso, soprattutto con i metodi di lega convenzionali. Pertanto, lo sviluppo di un metodo di sintesi in cui la composizione elementare, la dimensione e fase delle particelle possono essere controllate con precisione potrebbe portare a un nuovo repertorio di leghe e nanostrutture con funzionalità senza precedenti. Difatti l’obiettivo possibile è ottenere nanoparticelle non a fase separate, o definita a bassa entropia, ma a fase più omogenea o ad altra entropia ( Figure 1). Da un gruppo di ricercatori americani [12 ] è stato sviluppato un metodo alquanto semplice di shock carbotermico a due fasi che impiega il riscaldamento ed il successivo rapido raffreddamento repentino di fibre di carbonio, caricate con elementi metallici, che vengono usate come supporto per la produzione di nanoparticelle in lega con un massimo di otto elementi diversi( Figure 2).Avvenuta la sintesi delle particelle, ad oggi, è molto difficile poterle separare dal supporto attraverso le quali sono state ottenute; dunque, per valutarne la biocompatibilità e la possibile applicazione in campo biomedico le particelle devono essere testate direttamente sulle fibre di  carbonio. Il fine ultimo del presente lavoro di tesi è la produzione mediante elettrospinning delle fibre di poliacrilonitrile( PAN), la successiva carbonizzazione delle stesse e, dopo aver effettuato una caratterizzazione dimensionale delle fibre ottenute, la valutazione della biocompatibilità tramite prove in vitro, eseguite sia su matrici elettrofilate in PAN che che su quelle di carbonio. L’obiettivo finale è l’ottenimento del grado di tossicità del supporto usato per ottenere le nanoparticelle metalliche che può fortemente influenzare il comportamento di queste ultime. Il lavoro svolto è presentato sinteticamente nella mappa concettuale in Figura 3 . Il capitolo 1 introduce al lettore l’argomento delle fibre di carbonio; un breve excursus storico le presenta fino a concludersi con le loro applicazioni odierne ed attualmente in commercio. La versatilità del materiale e dei prodotti ottenibili permette di applicare le fibre in molti campi diversi ed eterogenei( Figure 4);  attualmente nel campo biomedico , sono in commercio, prodotti protesici formati da carbonio e fibre di carbonio grazie alle loro principali proprietà, quali il peso contenuto ed un’alta resistenza meccanica.  Il capitolo presta attenzione anche un’altra caratteristica delle fibre di carbonio che in campo biomedico assume fondamentale rilevanza cioè la loro biocompatibilità. Infatti, benché prodotti a base carbonio siano presenti da anni in commercio grazie alle loro indubbie e notevoli proprietà meccaniche, la loro biocompatibilità è ancora discussa e controversa. Per tale motivo, il lavoro svolto indaga la tossicità delle fibre di carbonio prodotte.   Nel capitolo 2 viene descritta la tecnica molto versatile dell’elettrospinning( Figure 5) attraverso la quale è possibile ottenere fibre polimeriche con diametro nanometrico. Nel dettaglio vengono presentate le caratteristiche fondamentali di tale tecnica e dei componenti del setup sperimentale( Figure 6). Inoltre, nelle descrizioni presenti nel capitolo, è volta particolare attenzione: al meccanismo di formazione della goccia di polimero dell’allungamento della fibra, della regione di instabilità della fibra ed al processo di evaporazione del solvente. Successivamente viene presentato un modello teorico che descrive la tecnica dell’elettrospinning e vengono analizzati esaustivamente molti parametri che influenzano la tipologia, la morfologia ed il diametro delle fibre. Infine, vengono presentati alcuni esempi degli ambiti nei quali le fibre con diametro nanometrico vengono usate o sono in fase di ricerca. Il capitolo 3 tratta dell’attività di laboratorio volta alla produzione effettiva dei filamenti a base di PAN ( Figure 7) ed alla loro conseguente carbonizzazione per ottenere fibre di carbonio; nel dettaglio, vengono presentati i parametri tecnici e sperimentali scelti per ottenere le fibre di PAN; successivamente, viene descritto il processo di carbonizzazione e come sono state ottenute le matrici con fibre di carbonio( Figure 8). Sono state effettuate analisi al SEM delle fibre sia di PAN che di carbonio ed attraverso il Software open source Fiji, plugin del software più conosciuto Imaj, ne è stato valutato il diametro attraverso la misurazione di 150 fibre di PAN e 150 fibre di carbonio. Il valore medio del diametro delle fibre di PAN risulta pari a 633 nm mentre per le fibre di Carbonio è pari a 875 nm.  Il capitolo 4 descrive il lavoro svolto nel laboratorio biologico di classe 2 e presenta i test biologici in vitro effettuati attraverso i quali è stato possibile valutare la tossicità dei materiali prodotti. Nello specifico il capitolo inizia con una descrizione sulla tipologia di fibroblasti usati ( i.e. NIH 3T3) per i test e sulle verifiche di proliferazione delle cellule NIH 3T3. Infatti tale valore è indicativo della qualità e della vitalità cellulare.  Successivamente, sono descritti i test di citotossitcità svolti utilizzando l’eluato posto a contatto 5 giorni con le fibre di PAN e per lo stesso periodo di tempo con le fibre di Carbonio. Sono state valutate tre diverse concentrazioni:   - ∂ = 50 mg/ml   - ∂ = 100 mg/ml   - ∂ = 500 mg/ml   La vitalità cellulare è stata valutata attraverso 3- bromide (4,5- dimethylthiazol-2 -yl) -2,5- diphenyltetrazoliocolorimeter ( test MTT). Dati i risultati di bassa vitalità cellulare nei test indiretti, sono stati svolti dei test qualitativi di vitalità cellulare in prove di contatto diretto delle cellule 3T3 con il substrato. Attraverso uno staining con DAPI è stato possibile valutare qualitativamente l’adesione e la vitalità delle cellule sulle fibre ( Figure 11). Dopo aver ottenuto risultati positivi sulla sopravvivenza cellulare nei test qualitativi diretti con DAPI, è stata valutata la vitalità cellulare, su fibre di PAN e fibre di Carbonio, attraverso il saggio quantitativo MTT.   Inoltre, è stata effettuata una valutazione di adesione cellulare sia sulle fibre di PAN che sulle fibre di Carbonio mediante la scannerizzazione al SEM ( figure 12).   I risultati dei test sia indiretti che diretti condotti per 1, 3 e 7 giorni di contatto tra cellule ed eluato ( nei test indiretti) o cellule e fibre elettrofilate( nei test diretti ) non sono del tutto positivi sulla vitalità cellulare a contatto diretto con le fibre di carbonio. Infatti, anche nei test indiretti la vitalità cellulare è fortemente influenzata dopo 7 giorni con l’aumentare della concentrazione di fibre rimaste a contatto con l’eluato. I risultati riportano che il medium di coltura rimasto a contatto con le fibre di carbonio ha sempre un comportamento più tossico nei confronti delle cellule di quello rimasto a contatto con le fibre di PAN( un esempio è riportato nelle Figure 13 e 14) come confermato dai test statistici svolti ( test di normalità dei dati, Anova test e t-Student test) per analizzare il comportamento dei valori di vitalità cellulare.  Nel capitolo 5, riguardante gli sviluppi futuri, sono suggerite possibili modifiche da apportare per migliorare le metodologie volte ad ottenere fibre di carbonio più biocompatibili. Infatti, dai risultati ottenuti si può affermare che sia la vitalità ed il comportamento cellulare non sono influenzati particolarmente dal contatto con fibre di PAN, mentre lo sono fortemente dal contatto con fibre di carbonio. Nel dettaglio, anche solo dopo 24 ore di contatto diretto con queste ultime, la vitalità è fortemente ridotta. Si suggerisce, quindi, di effettuare un’analisi superficiale delle fibre con la caratterizzazione degli elementi presenti attraverso, ad esempio , la tecnica della spettroscopia ad infrarossi. A seguito dell’analisi superficiale è consigliata una procedura di lavaggio e pulitura delle fibre attraverso sonicazione, per poter eliminare tutti quei residui di lavorazione che sono stati ipotizzati come principali cause che hanno fortemente influenzato il comportamento cellulare.  La tecnica proposta è facilmente utilizzabile in laboratorio senza la necessità di strumenti molto costosi e permette di ottenere una profonda pulizia dei materiali trattati( figure 17).  Infine, è suggerita una seconda analisi superficiale agli infrarossi cosicché si possa verificare la presenza o l’assenza degli elementi trovati sulla superficie prima della pulizia.  Dopo la procedura di lavaggio è proposto di poter effettuare nuovamente i test biologici in vitro per valutare che gli accorgimenti suggeriti siano effettivamente volti ad ottenere fibre di carbonio più biocompatibili. Nel capitolo 6, sono riportate le conclusioni del lavoro svolto e la valutazione della compatibilità biologica in vitro dei materiali considerati. È, inoltre, suggerito che qualsiasi test di vitalità e comportamento cellulare svolto di qualsiasi materiale o nanoparticella a contatto diretto con le fibre di carbonio non può portare a risultati attendibili a causa dell’alta tossicità delle fibre stesse. Dai risultati ottenuti dal lavoro svolto, si può concludere quanto segue: - le fibre di PAN hanno per: • 1 giorno di contatto un leggero comportamento citotossico; • 3 giorni di contatto un moderato comportamento citotossico; • 7 giorni di contatto un moderato comportamento citotossico; - le fibre di carbonio hanno per: • 1 giorno di contatto un severo comportamento citotossico; • Per 3 giorni di contatto un severo comportamento citotossico; • 7 giorni di contatto un elevato comportamento citotossico ( nessuna cellula era più viva) 