Engineered microscale strategies for cardiomyocyte maturation and contractility assessment

Cardiovascular disease (CVD) has long been recognised as worldwide leading cause of morbidity and mortality. This consciousness of CVD prevalence sets a fast pace for the deeper understanding on heart development and disease progression that ultimately lead to the development of new therapies. However, clinical studies still face several limitations regarding accuracy and cost-effectiveness of preclinical trials, largely due to the limited ability to model human cardiac physiology in vitro. Human induced pluripotent stem cells technology holds the potential to improve upon traditional cell culture and animal-based methods. However, cell immaturity remains an open issue in modelling cardiac disease. The present PhD Thesis aimed to engineer microscale platforms for the maturation and advanced functional assessment of cardiomyocytes in vitro. By tailoring relevant mechanotransductional cues, the ultimate goal is the generation of physiologically relevant cardiac models. A heart-on-chip platform to assess the influence of culture media perfusion on 3D engineered cardiac tissue maturation will be first presented. Microfluidic platforms engineered to apply relevant mechanical forces to cell cultures have proven to regulate cell phenotyping, cell-cell interactions and tissue functionality. The peristaltic perfusion system integrated on the platform represents an attractive alternative to traditional bulky electronic off-chip fluid handling systems (e.g. peristaltic pumps and syringe pumps) as it is compact and compatible with typical humidified cell culture incubators. The microfluidic valves integrated in the system are sequentially controlled to finely define the flow rate. This platform was used to study different flow rates and consequently different shear stress effect on neonatal rat cardiomyocyte microtissue functionality and maturation. Furthermore, a new technology allowing for the first time the measurement of electrical field potential within microfluidic 3D platforms was developed. This platform was designed to directly extract electrophysiological signals during culture. The developed system represents a powerful pre-clinical cardiac model to screen the cardiotoxic effects of new compounds. The platform design builds upon our previously published beating heart-on-chip, a platform able to condition 3D cell laden hydrogels through a combination of biochemical and mechanical (10% uniaxial strain at 1Hz) stimulations. The electrophysiological measurement was made possible by the inclusion of guide channels dedicated to the positioning of stainless steel electrodes. The effects of compounds known to alter the cardiac electrical activity were evaluated by the variations in the field potential morphology induced after incremental administration of the drug. Finally, a 2D microscale strategy to measure force generate by cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) will be presented. Nuclear lamina gene lamin A/C (LMNA) mutations cause a heterogeneous group of disorders, known as laminopathies, characterized by a spectrum of clinically distinct phenotypes (e.g. dilated cardiomyopathy and arrhythmia) whose molecular mechanisms still need clarification. Traction force microscopy (TFM) is a method used to evaluate the force generated by single cardiomyocytes by measuring the displacement of the surrounding substrate. In this technique, force calculation is made by video-optical recordings and takes into account the elastic properties of the substrate to which the cells adhere. The substrate was optimized to be suitable for both the imaging system and iPS cells. The forces computed were presented on a heat map of the cell and the total force was calculated considering the different regions. In sum, this dissertation focus on the role of biophysical stimuli in driving maturation of cardiomyocytes, as well as the development of new methodologies for the readout of functional characterization. Combining these technological advancements leverage the utility of cardiac in vitro models in predicting drug cardiotoxicity with high biological fidelity and its application to clinical studies.

Le malattie cardiovascolari sono riconosciute ormai da molti anni come la principale causa di patologia e morte nel mondo. Questa consapevolezza ha dato impulso ad indagini sempre più approfondite riguardanti lo sviluppo del cuore e l’avanzamento delle patologie cardiovascolari. Tutto ciò ha portato alla nascita di nuove terapie. Tuttavia, prima di arrivare agli studi clinici, bisogna affrontare ancora oggi numerosi problemi legati all’accuratezza e al costo dei test pre-clinici e soprattutto modellare in maniera più efficace la fisiologia cardiaca in vitro. L’utilizzo di cellule staminali umane pluripotenti può potenzialmente dare un impulso alle tradizionali colture cellulare e ai modelli animali, ma nonostante ciò, deve essere affrontato ancora il problema del basso livello di maturazione cellulare. Il presente lavoro di tesi si pone come obiettivo quello di sviluppare piattaforme ingegnerizzate alla microscala per garantire la maturazione e la valutazione funzionale avanzata di cardiomiociti in vitro. Il fine ultimo è proprio la generazione di modelli cardiaci fisiologicamente rilevanti, realizzati a partire da segnali meccanotrasduzionali adatti. Verrà perciò presentato un sistema cuore-su-chip per valutare l’influenza della perfusione del mezzo di coltura sulla maturazione di un costrutto cardiaco ingegnerizzato. È stato dimostrato che è possibile regolare il fenotipo delle cellule, le interazioni cellula-cellula e la funzionalità del tessuto tramite piattaforme microfluidiche in grado di applicare importanti forze meccaniche alle colture cellulari. La possibilità di integrare la perfusione peristaltica all’interno di un sistema di coltura rappresenta un’interessante alternativa all’utilizzo dei tradizionali sistemi di controllo delle portate fluidiche. In genere, infatti, ingombranti sistemi elettronici per la gestione delle portate vengono accoppiati ai chip (ad esempio pompe peristaltiche e pompe-siringa). Il sistema qui presentato, invece, è compatto e compatibile con l’ambiente umido tipico degli incubatori per colture cellulari. Alcune valvole microfluidiche integrate all’interno della piattaforma vengono controllate in modo sequenziale per definire la portata di fluido. Questo sistema è stato utilizzato per indagare gli effetti di diversi valori di portata, e quindi shear stress, sulla funzionalità e sulla maturazione di microtessuti generati da cardiomiociti neonatali di ratto. Inoltre, è stata sviluppata un’innovativa tecnologia che permette di misurare l’attività elettrica dei microtessuti cardiaci all’interno dei sistemi microfluidici. In particolare, è stata progettata una piattaforma che permette di estrarre direttamente un dato riferito ai segnali elettrofisiologici (es. potenziale di campo) durante la coltura. Tale sistema rappresenta un potente strumento pre-clinico, adatto a generare un modello cardiaco rappresentativo e a valutare gli effetti cardiotossici di nuovi composti. La piattaforma è stata disegnata a partire da un dispositivo cuore-su-chip in grado di generare un modello di cuore battente, precedentemente pubblicato dal nostro gruppo di ricerca. Esso consiste in un sistema in grado di condizionare costrutti tridimensionali composti da idrogeli caricati di cellule tramite una combinazione di stimoli biochimici e meccanici (10 % di deformazione uniassiale a 1 Hz). La misura elettrofisiologica viene attuata grazie a canali guida inclusi all’interno del sistema che permettono il posizionamento di elettrodi in acciaio inossidabile. Sono stati poi valutati gli effetti di composti che notoriamente alterano l’attività elettrica cardiaca andando a misurare le variazioni indotte nella morfologia del potenziale di campo in seguito all’amministrazione di dosi crescenti di composto. Infine, nel presente lavoro di tesi viene presentata una strategia per sviluppare supporti bidimensionali con integrato un sistema alla microscala per misurare la forza generata da cardiomiociti derivati da cellule staminali umane a pluripotenza indotta (hiPSC-CM). Le mutazioni del gene lamin A/C presente nella lamina nucleare (Nuclear lamina gene lamin A/C -LMNA) causano un gruppo eterogeneo di disordini, noti come laminopatie, caratterizzati da uno spettro di fenotipi clinicamente distinti (ad esempio cardiomiopatia dilatativa e aritmia) e le cui cause non sono ancora state completamente comprese. Per valutare la forza esercitata da un singolo cardiomiocita a partire dallo spostamento del substrato circostante si ricorre alla tecnica conosciuta con il nome di traction force microscopy (TFM). Il calcolo della forza viene eseguito con delle registrazioni video e tenendo in considerazione le proprietà elastiche del substrato al quale le cellule sono adese, substrato ottimizzato sia per il sistema di visualizzazione sia per le cellule iPS. Le forze calcolate vengono poi presentate su una mappa colorimetrica (heat map) della cellula e la forza totale esercitata viene calcolata valutando differenti regioni. In conclusione, la tesi si basa sul ruolo svolto dagli stimoli biofisici nel guidare la maturazione dei cardiomiociti e sullo sviluppo di nuovi metodi (es strumenti alla microscala integrati all’interno di piattaforme) volti ad eseguire una caratterizzazione funzionale. Questi avanzamenti tecnologici danno risalto all’utilizzo dei modelli cardiaci in vitro per predire la cardiotossicità dei farmaci in sistemi che riproducono fedelmente la biologia e quindi al loro utilizzo negli studi clinici.