Synthesis and characterization of boronolectins

Lectins are proteins able to bind reversibly and specifically to carbohydrates. This ability makes them suitable for biotechnological applications, indeed compounds able to detect carbohydrates have a huge potential as biomarkers, vectors for drug delivery, as well as support to cell culture and cell recognition. Nevertheless, natural lectins have several drawbacks, such as instability and high costs, which could be overcame by synthetic alternatives. Polymers containing boronic acid show distinctive reactivity and also self-assembly capability that allow potential synthetic lectin mimetics. In this thesis work, a new copolymer, precisely a quadri-block copolymer, containing boronic acid has been developed for the purpose of mimicking a general lectin. This material wants also to be easily accessible and developable, with high controlled structure. For these reasons, commercial monomers have been selected; a boronic acid (3-(acrylamido)phenylboronic acid) and three acrylamides, each of them with a specific functionality: hydrophilicity (N-Hydroxyethyl acrylamide), positive charge (Acrylamidopropyl)trimethyl ammonium chloride solution) and hydrophobicity (N-(3-Methoxypropil)acrylamide). Ultra Fast RAFT polymerization has been used not only because allows to reach well-controlled polymers in 3 minutes reaction but also because it keeps the livingness of polymer chains, in this way the copolymer has been achieved through sequential chain extensions, simply adding new monomer. Being so, every single piece of polymer chains was polymerized in strictly controlled conditions. For each monomer a system optimization was carried out and each copolymer block characterized via nuclear magnetic resonance spectroscopy, Fourier transform infrared spectroscopy and dynamic light scattering analysis. Once synthetized the aimed copolymer, its affinity with a carbohydrates, in detail a heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa, was tested and qualitative compared with other copolymers which present only one, or two, specific blocks – in addition to the boronic acid block – in order to better understand the importance of each of them. All synthetized copolymers showed heparin affinity. Despite non quantifiable, a relevant change was introduced by the positive charged block. Ultimately, the achieved material was proved to detect heparin concentration between 0.34 and 64 µM. Any future steps will have to focus on both testing different ranges of heparin concentration and different molecules, before using this material in cell cultures.

Le lectine sono proteine capaci di legarsi reversibilmente e specificatamente ai carboidrati. Questa proprietà le rende adatte per essere utilizzate in applicazioni biotecnologiche, infatti molecole in grado di individuare carboidrati hanno un grosso potenziale come biomarcatori, come vettori per drug delivery, come supporto in culture cellulari e riconoscimento cellulare. Tuttavia, queste molecole presentano diversi svantaggi, tra cui l’instabilità e gli elevati costi, che potrebbero essere superati da alternative sintetiche. Polimeri contenenti acido boronico hanno dimostrato una particolare reattività e capacità di auto assemblaggio che li rende potenziali alternative sintetiche, capaci di mimare le lectine. In questo lavoro di tesi, un nuovo copolimero, precisamente un copolimero a quattro blocchi, contenente acido boronic è stato sviluppato al fine di mimare una lectina. Questo materiale vuole essere anche facilmente accessibile, sviluppabile e con una struttura altamente controllata. Per questo motivo, monomeri commerciali e di facile reperibilità sono stati impiegati; un acido boronico (3-(acrylamido)phenylboronic acid) e tre acrilamidi, ciascuno con una specifica funzionalità: idrofilicità (N-Hydroxyethyl acrylamide), carica positiva (Acrylamidopropyl)trimethyl ammonium chloride solution) e idrofobicità (N-(3-Methoxypropil)acrylamide). Il copolimero è stato sintetizzato tramite Ultra Fast RAFT polimerizzazione che non solo consente di ottenere un buon controllo di sintesi in soli tre minuti di reazione, ma anche conserva la vitalità delle catene polimeriche; grazie a quest’ultima proprietà, il copolimero è stato sviluppato tramite sequenziali estensioni di catena, con la semplice aggiunta di nuovo monomero. Così facendo, ogni singolo tratto delle catene polimeriche è stato polimerizzato in condizioni strettamente controllate. Per ogni monomero, è stato ottimizzato il sistema di reazione e ciascun blocco caratterizzato tramite spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, spettroscopia in trasformata di Fourier e analisi di diffusione dinamica della luce. L’affinità per i carboidrati è stata testata con eparina sale sodica proveniente da mucosa intestinale porcina. Insieme al copolimero finale, anche copolimeri costituiti da uno, o più blocchi, sono stati testati al fine di valutare l’importanza di ciasucno. Tutti i copolimeri sintetizzati hanno mostrato affinità per l’eparina. Sebbene non quantificabile, il blocco con carica positiva ha introdotto un significativo cambiamento. In ultima istanza, il materiale sviluppato è in grado di rispondere a concentrazioni di eparina tra i 0.34 e 64 µM. Sviluppi futuri dovranno investigare sia intervalli di concentrazioni differenti di eparina, sia testare molecole differenti, prima di utilizzare questo materiale in culture cellulari.