Design and development of novel bioreactors for small intestine re-vascularisation : a whole organ tissue engineering approach

Given the high failure rate of intestinal allogeneic transplantation and given donor shortage organs, for an immune organ like the intestine a Whole Organ Tissue Engineering approach able to regenerate an organ from patient autologous cells remains the most effective solution. An engineered scaffold seeded and repopulated with patient autologous cells seems to be the right direction for new treatments. Vascularisation is a key cue to take in account while building up an engineered complex organ, it is a fundamental requirement and a crucial aspect for achieve nutrients and gasses transport within the whole construct following the in vivo implantation. In order to achieve this, for this thesis work a transversal approach is adopted, which allows to manipulate and control all the key factors needed to obtain the re-vascularisation of the intestine: cells, scaffolds and customized bioreactors. The main target of this thesis project was to design, manufacture and validate two different bioreactors. The first (WIPB) was a perfusion bioreactor that could allow the re-vascularisation of the intestine by perfusing both the mesenteric vascular tree both the intestinal lumen, thus achieving a structurally and fully functional vascular endothelium, stable over a long time period of time. The second was a bi-compartmental bioreactor that displays two sub-chambers: the only area of contact between the two compartments was the intestine, in order to assess if and how a gradient of VEGF and oxygen effectively gave direction to the formation of new blood vessels. The second main focus of this thesis project was to obtain a proper scaffold. It was obtained a decellularised a rat intestine with a gentle Detergent-Enzymatic-Treatment (DET) of 31 h: in this way it was possible to exploit the native vascular structure, otherwise inimitable. To optimize the scaffold co-culture studies with HUVECs and MABs were performed to assess the stabilization and support action of MABs on HUVECs vessel with the ultimate goal of exploiting their vessels network self-assembly property for the scaffold. It was also looked for a new possible scaffold hydrogel coating that could promote better results in the repopulation of the vascular tree: there were performed proliferation analysis seeding HUVECs on different hydrogels, reconstructed from the principal protein components of vascular ECM. The WIPB had very positive and encouraging outcomes. All the fluorescence images prove instantaneously the presence of cells in the vessel structure. Subsequent analysis have shown and confirmed a good re-endothelization of the vascular tree of the decellularised intestine: immunofluorescence assays and quantification shown that scaffolds cells underwent a physiological-like self-organization process. The Caspase3 analysis further confirm the better outcomes of the co-culture with HUVECs and MABs of the decellularised scaffold. Patency assay and quantifications have further demonstrated how the vessel structure is proper re-endotheliazed: the lumen is patent and totally perfusable, how it was also confirmed by the SEM analysis. The vascular permeability assays have demonstrated how with HUVECs and MABs after 7 days of perfusion with the WIPB leakage level is lower.

Dato l'elevato tasso di fallimento del trapianto allogenico di intestino e la carenza di donatori, per un organo immunitario come l'intestino un approccio di Ingegneria Tissutale in grado di rigenerare un organo dalle cellule autologhe del paziente rimane la soluzione più efficace. Uno scaffold ingegnerizzato seminato e ripopolato con cellule autologhe del paziente sembra essere la giusta direzione per nuovi trattamenti. Per ingegnerizzare un organo complesso, la vascolarizzazione è un requisito fondamentale e cruciale per ottenere il trasporto di nutrienti e gas all'interno dell'intero costrutto dopo l'impianto in vivo. In questo lavoro di tesi é stato adottato un approccio trasversale, che consentisse di manipolare e controllare tutti i fattori chiave necessari per ottenere la rivascolarizzazione dell'intestino: cellule, scaffold e bioreattori ad hoc. L'obiettivo principale é stato quello di progettare, produrre e validare due diversi bioreattori. Il primo (WIPB) é stato un bioreattore a perfusione che poteva consentire la rivascolarizzazione dell'intestino perfondendo sia la ree vascolare mesenterica sia il lume intestinale, ottenendo così un endotelio vascolare strutturalmente e funzionalmente corretto, stabile per un lungo periodo di tempo. Il secondo é stato un bioreattore bi-compartimentale che mostra due sotto-camere: l'unica area di contatto tra i due compartimenti era l'intestino in modo da poter valutare se e come un gradiente di VEGF e ossigeno diede efficacemente la possa effettivamente direzinonare l’angiogenesi. Il secondo focus della tesi é stato quello di ottenere uno scaffold adeguato. É stato decellularizzato un intestino tenue di ratto con un delicato trattamento detergente-enzimatico (DET) di 31 h: in questo modo e stato possibile sfruttare la struttura vascolare nativa, altrimenti inimitabile. Per ottimizzare lo scaffold, sono stati condotti in vitro studi di co-cultura di HUVECs e MABs per valutare la stabilizzazione e l'azione di supporto dei MABs sulla HUVECs e poter sfruttare le loro proprietà di autoassemblaggio in reti vascolari. È stato anche ricercato un nuovo possibile idrogelo con cui poter rivestire lo scaffold che portare a risultati migliori nel ripopolamento dell'albero vascolare: sono state eseguite analisi di proliferazione seminando HUVECs su diversi idrogeli, ricostruiti dai principali componenti proteici dell'ECM vascolare. Il WIPB ha avuto esiti molto positivi e incoraggianti. Tutte le immagini di fluorescenza dimostrano istantaneamente la presenza di cellule nella struttura del vaso. Le analisi successive hanno mostrato e confermato una buona ri-endotelizzazione dell'albero vascolare dell'intestino decellularizzato: test di immunofluorescenza e quantificazione hanno dimostrato che le cellule sono state sottoposte a un processo di auto-organizzazione simil-fisiologica. L'analisi di Caspase3 conferma ulteriormente i migliori risultati della co-semina sullo scafold e co-cultura di HUVECs e MABs. L’analisi di pervietà e le quantificazioni hanno ulteriormente dimostrato come la struttura dei vasi sia correttamente ri-endoteliazata: il lume è pervio e totalmente perfusibile, come è stato confermato anche dall'analisi SEM. I test di permeabilità vascolare hanno dimostrato come con HUVECs e MABs dopo 7 giorni di perfusione con il WIPB il livello di perdita di liquidi sia inferiore.